材料和试剂

移液器吸头（DNase / RNase-free，Sorenson Bioscience）
1.5 ml离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
细胞培养瓶（康宁，目录号：3056）
20 x 150 mm试管（Karter Scientific Labware Manufacturing，产品目录号：212W5）
Sephadex G-50柱（GE Healthcare，目录号：27-5330-01）
Whatman 3MM纸（GE Healthcare，目录号：3017-915）
柯达CL-XPosure薄膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM TM，目录号：34090）
手套（Ultra TEX手套，Taeshin生物科学，产品编号：UT-11）
电子。（CGSC，大肠杆菌基因库中心）（例子）
溶菌酶（Roche Diagnostics，目录号：10837059001）
TRIZOL（分子研究中心，目录号：TR 118）
氯仿（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
异丙醇（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
乙醇（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
RNA储存溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM7001）
碱性磷酸酶（Takara Bio，目录号：2250A）
DNase I（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2222）
RNasin核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2111）
PCI（苯酚：氯仿：异戊醇）溶液25：24：1（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：77617）
乙酸钠（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
RNase和DNase-free水（Bioneer，目录号：C-9011）
T4 RNA连接酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2141）
合成的3'RACE RNA寡核苷酸：3'-反式脱氧胸苷（3'-idT）RNA（Dharmacon）
3RP引物（5'AGCATGCGGCCGCTAAGAAC3'）
dNTP混合物（各10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0191）
HotStarTaq Plus DNA聚合酶（QIAGEN，目录号：203603）
Gal特异性引物（表1）

表1.每个半乳糖操纵子基因特异性引物列出的序列
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201L）
ATP，[γ-32 P] -6,000Ci / mmol（PerkinElmer，目录号：NEG002Z250UC）
5'末端标记的PE引物（5'GAGAGTAGGGAACTGCCA 3'）
5x显影剂（Vivid X-RAY显影剂，Duksan（DS）实验室，目录号：0514_00004）
5x定影剂（Vivid X-RAY RAPID FIXER，Duksan（DS）Lab，目录号：0514_00003）
胰蛋白胨（BD，Difco TM，目录号：211705）
酵母提取物（BD，Difco TM，目录号：212750）
氯化钠（NaCl）（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：746398）
半乳糖（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：G5388）
丙烯酰胺（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：V900845）
双丙烯酰胺（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：V900301）
5倍TBE（Bioneer，目录号：C-9002）
尿素（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：U5128）
过硫酸铵（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：248614）
TEMED（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
甲酰胺（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
0.5M EDTA，pH8.0（Bioneer，目录号：C-9007）
二甲苯蓝（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
1M Tris-HCl，pH8.0（Bioneer，目录号：C-9006）
蔗糖（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
Omniscript RT Kit（QIAGEN，产品目录号：205111）
Sigmacote（Sigma-Aldrich，目录号：SL2）
LB + 0.5％半乳糖（见食谱）
8％测序解决方案（请参阅食谱）
8％尿素-PAGE凝胶（见食谱）
2次凝胶加样混合（见食谱）
原生质体缓冲液（见食谱）

设备

自动移液器辅助装置（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：S1移液器填料）
移液器（美国Gilson公司）
37℃摇动培养箱（Hanbaek Scientific Co.，Korea（S））
37°C和42°C加热块（FINEPCR，韩国（S））
分光光度计（美国BECKMAN COULTER）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
4°C微型离心机（Beckman Coulter，USA）
NanoDrop 1000（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 1000）
PCR仪（Bio-Rad Laboratories，USA）
浅的固定器托盘（Bio-Rad Laboratories，USA）
测序凝胶电泳仪（LABREPCO，USA）
X射线盒（Duksan（DS）Lab，Korea（S））
电源（Bio-Rad Laboratories，USA）
高压灭菌器（Dong Won Scientific Corp，韩国（S））

软件

ImageJ的

程序

RNA提取
1. 拍出 E。用于在LB平板上提取RNA并在37℃孵育过夜。
2. 从有条纹的LB琼脂平板上选择单个菌落。接种 E。大肠杆菌菌株在3ml添加有0.5％半乳糖的新鲜LB培养基中培养，然后生长16小时。第二天，通过测量OD 600 600来评估细菌生长，通常是在4左右。
3. 在50ml预热（37℃）LB培养基中稀释培养物，补充0.5％半乳糖以获得约0.05的OD 600读数。
4. 在振荡培养箱中37°C培养细菌培养物。评估OD 600达到0.6，通常野生型大肠杆菌细胞需要1小时50分钟。此时，1ml培养物中的细胞数约为2×10 8个。
5. 在离心管中收集1ml细胞，离心沉淀细胞（12,000×g，1分钟，20℃）。
6. 弃去上清液，用50μl原生质体缓冲液重悬细胞沉淀，加入5μl溶菌酶（50mg / ml），充分混匀，在室温下孵育5分钟。
7. 加入500μlTrizol，涡旋振荡15秒。
  在室温下孵育裂解的样品5分钟
8. 加入100μl氯仿溶液，剧烈振荡15秒。在室温下将所得混合物温育5分钟，并在4℃下以12,000×gg离心15分钟。
9. 离心过程后，混合物分成3层：透明的上层水层（含RNA），中间层和红色下层有机层小心地将250μl上层水相转移到新鲜管中。
10. 通过混合250μl（等体积）的异丙醇，从水相中沉淀RNA。
11. 将样品在室温下储存10分钟，并在4℃下以12,000×gg离心15分钟。
12. 滗析上清液，用1 ml 75％乙醇振荡洗涤RNA沉淀。
13. 在12,000xg g离心RNA悬浮液5分钟4℃。
14. 通过重复离心过程去除剩余的乙醇，并短时间空气干燥RNA沉淀5分钟（空气干燥可以在室温下进行）。
15. 将RNA溶解在30μlRNA储存溶液中。
16. 用NanoDrop测量RNA的浓度。通常，可以从1ml的E中分离出800-1,000ng /μl的RNA。大肠杆菌文化。
脱氧核糖核酸酶I和碱性磷酸酶处理
1. 在1x AP反应缓冲液中重悬25μgRNA至终体积50μl。
2. 加入3U脱氧核糖核酸酶I和45U碱性磷酸酶，20U RNasin核糖核酸酶抑制剂，充分混合并在37℃孵育30分钟。
3. 加入50μlPCI，涡旋混合10秒。
4. 12000×g 离心5分钟
5. 收集30μl上清液，转移至Sephadex G-50柱。
6. 在2,000 em x g离心2 min，收集通过。
7. 用NanoDrop测量RNA浓度。通常，可以收集300-400ng /μl的RNA。
结扎
1. 3'-idT RNA寡聚物的去保护
  1. 短暂离心试管。
    加入400μl去保护缓冲液至管中，涡旋10秒并离心10秒。
  2. 在60°C孵育30分钟。
  3. 按如下方法进行苯酚提取和乙醇沉淀：向管中加入400μlPCI溶液，涡旋5秒钟。
  4. 在室温下12,000×g g离心5分钟。
  5. 小心地将300μl上层水相移至新管中。
  6. 加入2.5体积的冰冷的100％乙醇，0.1体积的3M乙酸钠，涡旋混匀。
  7. 在-80°C下沉淀20分钟。
  8. 12,000×g g离心20分钟，4℃。
  9. 滗析上清液并小心吸取剩余的上清液，通过加入500μl冰冷的70％乙醇洗涤沉淀两次。
  10. 在室温下风干颗粒并重悬于100μlRNase和DNase-free水中。
2. 建立一个20μL的反应如下：
  2μl10x RNA连接酶缓冲液
  0.25μlRNasin（40U /μl）
  1μlT4 RNA连接酶（5 U /μl）
  2.5μgRNA
  0.5μl3'RACE RNA oligo（100 nM）
  无RNase水
3. 在37°C孵育3小时 3'RACE RNA寡聚物的序列是5'P. UUCACUGUUCUUAGCGGCCGCAUGCUC.idT
4. 将连接混合物应用于G-50柱以进行缓冲液交换，以2,000×g离心2分钟并收集通过新微量离心管的通过。
逆转录
1. 装配3RP引物，将引物溶于无RNase和DNase的水中，制成100μM储备液（=浓度）。
  25μM的工作溶液是通过稀释RNase和DNase-free水而制成的。
  3RP引物序列（5'AGCATGCGGCCGCTAAGAAC3'）
2. 建立一个20μL的反应如下：
  2μl10x RTase缓冲液
  0.25μlRNasin（40U /μl）
  1μlRTase（4 U /μl）
  连接产物13.75μl
  1μl3RP引物（25μM）
  2μldNTP混合物（5 mM）
3. 在37°C孵育2小时。
PCR
1. 组装引物，如表1所示。
2. 建立一个50μL的反应如下：
  5μl10x PCR缓冲液
  0.5μlHotStarTaq加DNA聚合酶（5U /μl）
  1μldNTP混合物（10 mM）
  1μl3RP引物（25μM）
  2.5μlgal特异性引物（10μM）
  2μlcDNA
  38μlRNase-free水
3. 将PCR管置于预热至105°C的PCR仪上并运行热循环过程。表2中显示了PCR的热循环条件。
  
  表2. PCR的热循环条件
引物末端标记
1. 设置以下反应至最终体积为20μl：
  2μl10x激酶缓冲液
  1μl激酶（10U /μl）
  2μl引物（10μM）
  2μl[γ-32 P] ATP
  
  13μlRNase-free水
2. 在37°C孵育30分钟
3. 在65°C灭活酶30分钟
4. 向反应混合物中加入30μlRNase和DNase-free水，通过离心机以2000×g / em的速度通过G-50柱2分钟。
5. 将标记的引物保存在4°C。
引物扩展
1. 设置以下反应至最终体积为20μl：
  2μl10x PCR缓冲液
  0.2μlHotStarTaq加DNA聚合酶（5 U /μl）
  
  0.3μldNTP混合物（10 mM）
  0.3μl5'末端标记的PE引物 2μlDNA模板
  
  15.2μlRNase-free水
2. 将PCR管置于预热至105°C的PCR仪上并运行热循环过程。表3列出了PCR的热循环条件。
  
  表3. PE的热循环条件
凝胶电泳
1. 凝胶铸造
  1. 根据制造商的说明组装凝胶并将凝胶固定在凝胶浇铸室中。使用0.4毫米厚的垫片，玻璃板（内板x外板（宽x高）：31 x 38.5厘米），4 x 0.4毫米（14厘米）凝胶梳）。
  2. 准备50毫升的8％尿素-PAGE溶液。
  3. 立即使用两块玻璃板之间的自动移液器将凝胶倒入。避免引入气泡。插入梳子，让凝胶聚合60分钟。组装后的凝胶如图2所示。
    
    图2.使用自动移液器辅助装置的凝胶注射室中的凝胶装配图
2. 设置电泳装置并预凝胶
  1. 根据制造商的说明将凝胶从流延室中取出并将其组装到凝胶设备中。
  2. 用1x TBE运行缓冲液填充下部缓冲液室，以便玻璃板用缓冲液浸没2-3cm。
    使用1x TBE运行缓冲液将上部缓冲液室填充到凝胶顶部。
  3. 。小心取出梳子，用移液器和凝胶加样针头冲洗缓冲液
  4. 连接凝胶系统的盖子并将电缆插入高压电源。加载样品前，您必须预先凝胶至少30分钟以加热凝胶并从凝胶中除去剩余的尿素。最佳温度应在45-55°C之间。避免温度高于60°C，因为条带可能会弄脏或玻璃板可能会开裂。为预运行选择恒定功率（30 W）。组装的电泳装置如图3所示。
    
    图3.组装电泳仪的图片
3. 样品制备
  1. 向15μl样品中加入15μl2x凝胶加样混合物。
  2. 在95°C加热3分钟使样品变性
4. 加载并运行凝胶
  1. 如前所述，取下盖子并彻底冲洗水井，因为尿素会渗入井中。
  2. 从孔底部小心加载3μl样品。避免引入气泡。
  3. 组装盖子并在30 W下运行凝胶以保持与预运行相似的凝胶温度55°C。观察标记染料的迁移直至染料前端达到凝胶的下端。运行可能持续2-4小时。
5. 处理凝胶
  1. 松开夹子将凝胶盒从腔室中取出。拉开垫片并仔细拆卸玻璃板。如有必要，切开含有凝胶部分的上部孔。
  2. 小心地将凝胶包裹在凝胶顶部，用透明胶带密封。 Whatman 3MM剪纸和saran包装的图片如图4所示。
  3. 将密封的凝胶移至X射线盒，放入单片X光胶片，在-80°C下暴露16小时。
    
    图4.显示Whatman 3MM纸张与外层纸板或凝胶切割大小相同的图片，用透明胶带密封的saran包装放置在X光盒中 />
  4. 曝光时间后，从冰箱中取出磁带，等待大约1小时，直至温度升至室温。
  5. 在黑暗的房间里开发X光胶片。首先，将显影剂的一份浓缩物稀释到4份水。混合并储存在瓶子里。以相同的方式准备固定器。然后，将显影剂倒入容器中，将曝光后的X光胶片从暗盒中取出，将胶片浸入显影剂中。几分钟后，出现暗带时，用蒸馏水冲洗薄膜，然后将薄膜固定在定影液中。

数据分析

该数据可以被扫描，并使用软件定量“的ImageJ”（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）。 ImageJ是由Wayne Rasband和来自美国国立卫生研究院的其他人提供的基于Java的软件。

扫描胶片并设置测量标准
1. 以.tiff文件格式从电影创建高分辨率扫描。将其保存为源图像，并将其用于定量分析。
2. 启动ImageJ分析软件并使用“文件”菜单从目标文件夹加载以前保存的.tiff文件。将图片格式更改为.jpeg并将图片模式更改为“灰度”。
3. 在“分析”菜单下，选择“设置测量”。从复选框中选中'区域'（图5）。
  
  图5.显示菜单和工具功能的ImageJ软件界面下面的图解释了“设置测量”选项的不同类型，选中“区域”以便对3'端特定量化。 br />
选择测量
1. ImageJ选择的测量值定义了3'RACE最终PE产品泳道的矩形区域。从ImageJ中选择“矩形”工具，并在样本的条带周围画一个框架。
  备注：
  1. 您可以追踪并调整框架大小。
  2. 调整它以覆盖区域以包含整个样本行的最大和最小带。
2. 对于每个分析进行测量（例如图6），第一条车道将作为控制对象，车道上的所有其他条带将作为量化和比较的样本。在框架中央对齐乐队，并使用'Ctrl'+'M'记录测量结果或从'分析'菜单中选择'测量'。
3. 这将展开测量窗口并按顺序显示样本的面积峰值。通过使用“直线”工具绘制手绘线以找到各个样品峰的面积，制作样品的封闭峰。应用'魔杖'工具可获得如图6所示的单个样品峰的面积。
  
  图6.使用ImageJ量化3'RACE-PE结果的示例。：一种。半乳糖操纵子的示意图。来自P1启动子的转录起始位点标记为+ 1.用小箭头指示用于扩增mT1的3'末端的引物的位置。通过3'RACE-PE显示WT和Δspff菌株中emTamT mRNA的3'末端的凝胶图像。每张凝胶图片侧面的数字表示与P1转录起始位点（+1）的相对位置（Lee等人，2008）。 B. mT1频带的峰值和面积表。 “矩形”工具以黄色框起的波段用于获取波峰并找到这些3'末端波段的区域。
电子表格和计算
1. 当获得带的峰值区域以及加载控制带时，将数据传输到Excel工作表。
2. 当记录相对于对照带的样品带的面积时，计算样品带值与该泳道的对照带之比（图6.泳道1（对照）中的泳道2,3,4）。 />
3. 最终的相对定量值是样品带与对照带的比例。
4. 构建一个条形图（或其他）图形来比较样本与控件的关系。

笔记

起始样本量不应超过Trizol试剂的容量。
过载会降低RNA的质量
在整个实验过程中使用不含RNase的试剂和过滤器吸头。
在整个过程中戴上手套并保持管子关闭
PCR循环可以根据产品的量进行修改。
可以根据带的强度来修改在-80℃下从凝胶暴露在X射线胶片上的时间。
应指定实验室的特定区域进行P-32处理。处理放射性物质时，请始终穿戴防护手套和衣服，并使用树脂玻璃罩防止辐射。尽量保持曝光时间尽可能短。放射性物质应保存在铅衬里的容器中，实验废物应放在指定的容器内。
使用盖革计数器检查防护罩和手套的辐射水平，以防污染。

食谱

LB + 0.5％半乳糖（1 L）
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl

加蒸馏水至1升高压灭菌器
加入25毫升过滤的20％半乳糖
在室温下储存
8％测序溶液（1 L）
76克丙烯酰胺
4克双丙烯酰胺

200毫升5x TBE 500克尿素

加蒸馏水至1升加热搅拌溶解
8％尿素-PAGE凝胶（50毫升）

49.67 ml 8％测序解决方案 300μl10％APS溶液
30μlTEMED
2倍凝胶加样混合
9毫升甲酰胺
200μl0.5 M EDTA
100μl1％二甲苯氰醇
100μl1％溴酚蓝

加RNase和DNase-free水至10 ml
原生质体缓冲液
750μl1 M Tris-HCl（pH8.0）
7.7克蔗糖
800μl0.5M EDTA（pH8.0）

加RNase和DNase-free水至50 ml

致谢

这项工作得到了中国青年科学家基金会（31600061）和中国博士后科学基金（2015M582234，2017T100562）的资助。这项研究也得到了忠南国立大学的资助（2015-1420-01）。该协议改编自我们在J Mol Biol（Lee等人，2008年），J Bacteriol（Wang等人）的出版物（Wang等人。，2014）和 PNAS （Wang et。，2015）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Altman，S.和Robertson，H. D.（1973）。在 RNA前体分子和核糖核酸酶中。大肠杆菌。 Mol Cell Biochem 1（1）：83-93。
Holden，H.M。，Rayment，I.and Thoden，J.B。（2003）。 Leloir途径的半乳糖代谢酶的结构和功能 J Biol Chem 278（45）：43885-43888。
Lee，H.J.，Jeon，H.J.，Ji，S.C.，Yun，S.H。和Lim，H.M。（2008）。 mRNA梯度的建立取决于启动子：基因表达极性的调查。 J Mol Biol 378（2）：318-327。
Nudler，E.和Gottesman，M.E。（2002）。大肠杆菌中的转录终止和反终止基因细胞 7（8）：755-768。
Sambrook，J。和Russell，D.W。（2006）。 3'cDNA末端快速扩增（3'-RACE）。 CSH Protoc 2006（1）。
Schneider，C.A.，Rasband，W.S。和Eliceiri，K.W。（2012）。 NIH Image to ImageJ：25年的图像分析 Nat Methods 9（7）：671-675。
Wang，X.，Ji，S.C.，Jeon，H.J.，Lee，Y.，Lim，H.M。（2015）。斑点42对galK表达的二级抑制：mRNA mK2的降解和增强的转录在galK基因之前终止。 Proc Natl Acad Sci USA 112：7581-7586。
Wang，X.，Ji，S.C.，Yun，S.H.，Jeon，H.J.，Kim，S.W。和Lim，H.M。（2014）。 gal操纵子中每个顺反子的表达可以通过转录终止和产生galk特异性mRNA，mK2。 J Bacteriol 196：2598-2606。
Zhao，J.，Hyman，L。和Moore，C。（1999）。在真核生物中形成mRNA 3'末端：机制，调控以及与mRNA合成中其他步骤的相互关系。 Microbiol Mol Biol Rev 63（2）：405-445。