材料和试剂

移液器吸头
胰岛素注射器（BD，目录号：324826）
5毫升注射器（BD，目录号：302187）
25 G针（Terumo，产品目录号：GS-351）
50毫升试管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
带有盖子的FACS管（Corning，Falcon ，目录号：352058）
小鼠：C57BL / 6成年女性（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
注：此协议已针对C57BL / 6小鼠开发。对于其他小鼠品系，应调整MSU浓度和直至腹膜灌洗的最佳时间。
单钠尿酸盐（MSU）晶体（InvivoGen，目录号：tlrl-msu）
针对Ly6G的荧光抗体（例如，AlexaFluor647抗Ly6G [克隆1A8]，BioLegend，目录号：127609）
针对Ly6B.2的荧光抗体（也称为7/4抗原;例如Fitc抗Ly6B.2 [克隆REA115]，Miltenyi Biotec，目录号：130-103-318）
针对CD3ε的荧光抗体（例如，PE-CF594抗CD3ε[克隆145-2C11]，BD，BD Biosciences，目录号：562286）
针对CD45的荧光抗体（例如，Pacific Blue抗CD45 [克隆30F11]，BioLegend，目录号：103126）
活死亡鉴别器（例如Zombie NIR Fixable Viability Kit，BioLegend，产品目录号：423105）
小鼠IL-1β/ IL-1F2 DuoSet ELISA试剂盒（R＆amp; D Systems，目录号：DY401）
用于ELISA的底物试剂包（R＆amp; D Systems，目录号：DY999）
Dulbecco改良的PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537-500ML）
胎牛血清（例如，PAN-Biotech，目录号：P40-47100）
FACS缓冲液（见食谱）

设备

移液器
解剖工具（锋利的剪刀和镊子）
Neubauer细胞计数室或自动细胞计数器
冷冻台式离心机
流式细胞仪
ELISA平板阅读器

程序

整个过程总结在图1中。所有的动物实验均按照瑞士动物福利法进行。

图1.程序概述该方案总结了该方案的主要步骤，用于通过腹膜内注射MSU评估体内炎性体活化。

MSU注射到腹膜腔内（见视频1，该图显示了如何进行腹腔内注射）

视频1
1. 准备MSU悬浮液：向一小瓶MSU晶体（5mg）中加入0.5ml无菌PBS并彻底涡旋（> 5分钟用于初始重悬，稍后涡旋1分钟就足够了）以获得10mg / ml MSU的悬浮液。
  注意：MSU晶体不溶于PBS并以悬浮液形式注入。不要离心;使用前涡旋1分钟。
2. 根据当地的动物福利法和动物实验许可证，通过耳朵或脚趾夹子标记每只小鼠。
  注意：由于实验持续时间最长为16小时，因此可以使用防水台标记暂时标记小鼠。
3. 使用胰岛素注射器将180μlMSU悬液或180μl无菌PBS（对照小鼠）注入腹腔：
  1. 在吸入注射器之前旋转MSU悬架
  2. 按住鼠标稍微向其头部倾斜
  3. 以30°-45°的角度插入针。确保你在腹腔内，并缓慢注入悬浮液。
腹腔灌洗和收集细胞
在所需的分析时间点（通常在MSU注射后4小时，8小时和16小时）进行视频2所示的腹膜灌洗：

视频2
1. 颈椎脱臼或CO 2窒息安乐死小鼠。
  注意：处理一只小鼠后，小鼠在细胞采集完成前不应变硬。请注意，颈椎脱位安乐死时血管不会渗入腹腔。
2. 小心打开腹部皮肤，不会损伤腹膜。
3. 使用25 G针头将5 ml PBS注入腹腔
4. 摇动鼠标2-3分钟。
5. 使用相同的注射器从腹膜腔内吸出PBS，转移到50ml锥形管中，测量回收的PBS的量。
  注意：有经验的实验者可以恢复约。 4毫升注射的PBS。
6. 使用Neubauer计数室或自动细胞计数器确定每毫升的细胞浓度。
  注：红细胞裂解不是必需的，但要确保不要计数红细胞，碎片或脱细胞。
流式细胞术来表征细胞浸润
1. 从每个灌洗液中取1×10 6个细胞，旋下，转移到FACS管中。
2. 重悬细胞在50μLPBS含有：
  1. AlexaFluor抗Ly6G抗体，1μg/ ml;
  2. Fitc抗Ly6B.2抗体，1μg/ ml;
  3. PE-CF594抗CD3ε抗体，0.5μg/ ml;
  4. 太平洋蓝抗CD45抗体，0.5μg/ ml;
  5. 僵尸-NIR活死查杀器（稀释1：800）。
3. 在冰上孵育20分钟
4. 加入100μlFACS缓冲液
5. 在350 em xg 下旋转5分钟
6. 取出上清液并用100μlFACS缓冲液再次清洗。
7. 重悬于100μlFACS缓冲液中并在流式细胞仪上进行分析。图2显示了用于鉴定活的单个CD45 +细胞的典型结果和门控策略。
  
  图2.门控策略门控策略，用于排除分析中的碎片，双合和死亡单元。
8. CD45 +，Ly6G +，Ly6B.2 +细胞是嗜中性粒细胞。图3A显示了当在单个活CD45 +细胞上选通时的典型流式细胞计点图。
  
  图3.来自流式细胞术的代表性数据A.腹膜内注射MSU后4小时收集的腹膜细胞的代表性流式细胞术图。 B.浸润性嗜中性粒细胞（左）和T细胞（右）的相对和绝对数量的代表性结果。每个点代表一只老鼠。
腹腔灌洗液中IL-1β的定量
1. 从步骤B6中取0.5 ml腹腔冲洗液。
2. 旋转细胞，使用上清液进行分析。
  注：IL-1β水平可能相当低;不要稀释上清液进行ELISA分析。
3. 根据制造商的说明进行IL-1βELISA。
  图4显示了腹腔灌洗液中IL-1βELISA的典型结果。
  
  图4.来自ELISA测量的代表性数据。 IL-1β腹膜内MSU注射后8小时从WT和NLRP3 - / - 小鼠收集腹膜灌洗的ELISA。对于灌洗，将3ml的PBS注射到腹腔中。每个点代表一个鼠标。

数据分析

浸润性嗜中性粒细胞的数量计算如下：

计算嗜中性粒细胞的绝对数量：步骤B6中获得的细胞浓度（每毫升细胞数）×5 =细胞总数。
计算单个活的CD45 +细胞的Ly6G + + Ly6C + +细胞的细胞总数×频率计算浸润性嗜中性粒细胞的数量=渗透性嗜中性粒细胞的绝对数量。
因此，计算将是：

随着细胞浓度。 =步骤B6中获得的细胞浓度;和频率= Lys6G + + / Ly6B.2 + +门中细胞的比例（见图3A，左图）。
如果需要，使用相同的方法来确定腹膜中T细胞的绝对数量，使用活的单个CD45 +细胞内CD3 +细胞的频率。图3B显示了用这种方法获得的典型结果。

笔记

所有动物实验应根据当地动物福利立法进行。
对于C57BL / 6小鼠测试MSU的使用浓度，如果使用其他小鼠品系，则可能需要滴定。
作为炎症小体激活的一种测量，4小时和/或8小时是典型的分析时间点。但是，该实验也可以进行长达24小时。然而，在较晚的时间点，次要因素影响结果，浸润细胞的数量可能不再与炎性体活性直接相关。
腹膜灌洗液中的IL-1β水平可能相当低。如果IL-1β测量是主要读数，则可以用少至2.5至3ml的PBS进行灌洗。但是，这会导致回收电池的数量减少，因为只有约。
可以回收2.0至2.5毫升注入的PBS。
我们通常使用Nlrp3 - / - 小鼠作为MSU诱导的腹膜炎的阴性对照，因为这些小鼠对主要参与识别MSU的炎性体受体有缺陷。

食谱

FACS缓冲液
补充Dulbecco PBS和2％胎牛血清
保持无菌状态并在4°C储存长达2个月

致谢

该协议首先由Chen等人描述。（2006），并且由我们小组进行了进一步研究（Spalinger等人，2016年），该研究得到了瑞士国家科学基金会（314730-146204; CRSII3_154488 / 1 ; 310030-120312），ZürcherUniversitäts-Verein和瑞士慈善基金会。作者声明不存在利益冲突或竞争财务利益。

参考

Chen，C.J.，Shi，Y.，Hearn，A.，Fitzgerald，K.，Golenbock，D.，Reed，G.，Akira，S。和Rock，K.L。（2006）。 MyD88依赖性IL-1受体信号传导对于由单钠盐尿酸盐晶体刺激的痛风炎症是必不可少的。 a> J Clin Invest 116（8）：2262-2271。
Martinon，F.，Agostini，L.，Meylan，E.和Tschopp，J。（2004）。鉴定细菌胞壁酰二肽作为NALP3 / cryopyrin炎症小体的激活剂 Curr Biol 14（21）：1929-1934。
Martinon，F.，Burns，K。和Tschopp，J。（2002）。炎症小体：触发炎性半胱天冬酶活化和proIL-β加工的分子平台。 Mol Cell 10（2）：417-426。
Martinon，F.，Mayor，A.和Tschopp，J。（2009）。炎症小体：身体的监护人。 Annu Rev Immunol 27：229-265。
Martinon，F.，Petrilli，V.，Mayor，A.，Tardivel，A.和Tschopp，J。（2006）。痛风相关的尿酸晶体可激活NALP3炎性体。 440（7081）：237-241。
Meylan，E.，Tschopp，J.和Karin，M。（2006）。宿主反应中的细胞内模式识别受体 Nature 442（7098）：39-44。
Spalinger，MR，Kasper，S.，Gottier，C.，Lang，S.，Atrott，K.，Vavricka，SR，Scharl，S.，Gutte，PM，Grutter，MG，Beer，HD，Contassot，E.， Chan，AC，Dai，X.，Rawlings，DJ，Mair，F.，Becher，B.，Falk，W.，Fried，M.，Rogler，G。和Scharl，M.（2016）。 NLRP3酪氨酸磷酸化受蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN22控制。
Zhou，R.，Yazdi，A. S.，Menu，P.和Tschopp，J。（2011）。线粒体在NLRP3炎症小体激活中的作用 Nature 469（7329）：221-225。