材料和试剂

1.5 ml微量离心管（DOT Scientific，目录号：509-FTG）
铝箔（Spring Grove）
6孔板（Corning，Costar 2741®，目录号：3506）
70微米细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
1毫升胰岛素注射器（BD，目录号：329420）
3毫升注射器（Covidien，目录号：8881513918）
5毫升聚苯乙烯圆底管（流式细胞仪试管; Corning，Falcon，目录号：352008）
15毫升锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352097）
96个圆底孔板（SARSTEDT，目录号：82.1582.001）
MACS LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
小鼠，C57BL / 6J，5-6周龄（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
抗CD45.2 PE克隆104（Tonbo Biosciences，目录号：50-0454-U100; 0.2mg / ml）
肝素钠注射液（Sagent Pharmaceuticals，NDC 25021-400-10; 10,000 USP单位/ 10ml）
磷酸盐缓冲液（PBS）（Corning，Mediatech，目录号：21-040-CV）
异氟醚（Piramal Healthcare，001725CS）
抗PE微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-801）
活/死固定Aqua试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：L34957）
CD1d-四聚体（PBS57-加载的CD1d-单体和四聚体，可从NIH四聚体核心设施获得; http：//tetramer.yerkes .emory.edu ）
抗CD25克隆PC61（例如，BioLegend，目录号：102024）
抗TCRβ克隆H57-597（例如，BD，BD Biosciences，目录号：562841）
抗CD4克隆RM4-5（例如，BioLegend，目录号：100548）
抗CD8α克隆53-6.7（例如，BD，BD Biosciences，目录号：563332）
抗CD5克隆53-7.3（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：47-0051-82）
抗CD122克隆TM-b1（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：46-1222-82）
抗H-2K克隆AF6-88.5（例如，BD，BD Biosciences，目录号：562942）
抗PD-1克隆J43（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：17-9985-82）
抗NK1.1克隆PK136（例如，BioLegend，目录号：108705）
抗CD11c克隆N418（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：25-0114-82）
抗I-A / B克隆AF6-120.1（例如，BioLegend，目录号：116421）
抗CD19克隆1D3（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：56-0193-82）
抗CD11b克隆M1 / 70（例如，Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：11-0112-41）
抗GR1克隆Gr-1（例如，BioLegend，目录号：108411）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150），在65°C下热灭活。
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
叠氮化钠（Fisher Scientific，目录号：BP922I-500）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：A4514-500G）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Fisher Scientific，目录号：P235-500）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
FACS缓冲液（见食谱）
ACK裂解缓冲液（见食谱）
MACS缓冲区（请参阅食谱）

设备

二级生物安全柜/层流罩
MACS Multistand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
QuadroMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-976）
加热灯
定时器（Fisher Scientific，目录号：14-649-17）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12-R）
2000毫升下降玻璃瓶
冰箱（4°C）（Fisher Scientific，型号：Isotemp TM通用系列实验室冰箱）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629-1EA）
FACS流式细胞仪（BD，型号：LSR-II，H10.10）

软件

FlowJo 10.4.0版

程序

注意：所有的动物程序都必须得到贵机构伦理委员会的批准

静脉注射标本和样品制备
注：在具有排气装置的II级生物安全柜/层流罩中执行步骤A6-A8。图1显示了直到组织收集的过程概要。

图1. IV标记和组织收集的概述在磁性细胞分选之前的实验程序如正文中所述。快速工作和一次做一只动物是很重要的，这样从注射到单细胞悬液的时间在样品间变化不大。
1. 准备抗CD45-PE / PBS溶液（1μg/ 200μl）：在1.5 ml微量离心管中的195μlPBS中稀释5μl抗CD45.2-PE，涡旋，置于冰上，盖上铝箔。 br /> 注意：建议准备5-10％以上的解决方案，以解决注射器死腔内的溶液损失问题。
2. 准备一个6毫升板与5毫升FACS缓冲区（见食谱）和一个70微米细胞过滤器收集胸腺，置于冰上。
3. 使用20μl肝素制备1.5 ml微量离心管以收集血液，置于冰上。
4. 每次使用一只动物，用热灯预热小鼠直至尾静脉扩张（通常〜5分钟），不断监测小鼠以避免过热或燃烧。
5. 设置计时器3分钟。当尾静脉扩张时，使用1ml胰岛素注射器将200μl抗-CD45-PE / PBS溶液注入尾静脉。注射后立即启动计时器。
  注意：包括注射200μlPBS作为阴性对照的小鼠。
6. 在计时器运行时，在带有排气装置的II级生物安全柜内准备一个玻璃瓶，用于异氟醚滴注法：将浸有2 ml异氟醚的折叠纸巾放入2,000 ml滴落式玻璃瓶的底部，并将插入物放在确保异氟醚浸泡的组织和小鼠的物理分离。
7. 当定时器在注射后3分钟关闭时，将鼠标放在准备好的玻璃瓶内并关上盖子。
8. 1分钟后（小鼠应该麻醉），颈椎脱位安乐死小鼠。
9. 用1 ml胰岛素注射器打开动物胸部并通过心脏穿刺收集血液：将针头插入心脏约5 mm，轻轻拉动柱塞（图2A和2B）。将注射器内容物（通常约0.2-0.5ml）倒入肝素化的1.5ml微量离心管中，并将收集管置于冰上。
  使用铝箔覆盖样品以防止光照直至进一步处理。
10. 收集胸腺并去除附着在胸腺外的血管（图2C-2E）。在冰上悬浮于5ml冷FACS缓冲液（带有70μm细胞过滤器的6孔板）中，立即通过将其与3ml注射器的柱塞混合并将其通过细胞滤网压入孔中来使组织分离。用剩余的结缔组织丢弃过滤器。重复每个胸腺。
  使用铝箔覆盖样品以防止光照直至进一步处理。
11. 血液样本：将血液转移到5ml流式细胞仪管中，加入2ml ACK裂解缓冲液（参见食谱），在室温（RT）保持2分钟，在524xg（1,500rpm）下旋转3分钟RPM），4℃，弃去上清液。重复2次（在ACK裂解缓冲液中重悬沉淀），最后将细胞重悬于1ml冷FACS缓冲液中并置于冰上。
  
  图2.心脏血液和胸腺收集概述A.胸腺位于心脏上方。 B.用胰岛素注射器从心脏抽血。 C.为了去除胸腺，用一把弯曲的镊子在基座上调整它并轻轻地拉动。 D.胸腺被血管覆盖，应尽可能用弯曲的镊子将其去除。 E.去除衬里血管后的胸腺。
来自胸腺样品的i.v.-标记的（IV + +）细胞的MACS富集
1. 通过血细胞计数器测定每个样本的细胞计数（通常为150-250 x 10 6）。
2. 重悬细胞至1×10 7 /80μlMACS缓冲液（见食谱）。
3. 将每个样品40μl（5×10 6）置于一旁作为未触及的对照，并用FACS缓冲液填充至1ml，保持在冰上。用铝箔盖住。
4. 根据Miltenyi协议（包含在抗PE微珠中），每80μl添加20μl抗PE珠粒到剩余的悬浮液中。
  注意：根据我们的经验，该协议也适用于较少量的珠子。例如，将细胞重悬于1×10 7 em /40μlMACS缓冲液并加入10μl珠子。珠子的进一步减少可能是可能的。如果看到丰富的细胞，一部分胸腺样本可能足以进行富集。
5. 混合，并在冰箱（4°C）中孵育15分钟，避光。
6. 用1ml MACS缓冲液洗涤样品2次（在524×g（1,500RPM），4℃旋转5分钟，弃去上清液，重新悬浮在MACS缓冲液中）。
7. 第二次洗涤步骤后，将样品重新悬浮于500μlMACS缓冲液中至多1×10 8。
8. 使用LS柱和Miltenyi协议进行磁分离。
9. 收集15 ml离心管中的磁性标记（IV + ）部分。
  注：我们使用未经处理的样本部分作为对照。也可以收集来自磁分离步骤的流量作为阴性对照。我们通常在分析时观察到未触动的和流动的IV-部分之间没有差异。
用于流式细胞术的抗体和四聚体标记
1. 确定每个IV +洗脱样品（和IV-flow-through样品，如果收集的话）的细胞计数。
2. 在524xg RPM（1,500），4℃下旋转样品（包括未接触的部分）5分钟，弃去上清液，重新悬浮于200μlFACS缓冲液中，并将每个样品转移到96个圆形孔中，底部孔板，置于冰上。
  注：我们以每50μl主混合物（见下文）将样品染色至多5×10 6个细胞 6个细胞。每个胸腺的IV + 部分，未触及的部分通常在此范围内。如果收集流通部分，我们建议确定细胞数量并染色5×10 6细胞。
3. 确定血液样品的细胞数量并将每个样品5×10 6个细胞转移到单独的孔中。
4. Live / Dead鉴别器：在我们的实验室中，我们经常使用Live / Dead Fixable Aqua套件。我们使用这个试剂盒之前，标记感兴趣的标记，并在冰上用PBS（没有添加蛋白质）与1：1,000活/死鉴别器在冰上染色20分钟。这种胺结合鉴别剂可以染色已经失去膜完整性的细胞，而在分析FACS数据时应该排除阳性染色（死亡）细胞。
5. 用200μlFACS缓冲液洗涤样品3次（以524×g（1,500RPM）旋转5分钟，4℃，弃去上清液，重悬于FACS缓冲液中）。
6. 准备用于FACS标记的主混合物。我们在FACS缓冲液中使用1：200μl的大多数抗体和1：400的CD1d-四聚体，每5×10 6个细胞使用50μl。
  我们通常包括以下一组抗体来分析CD4 +CD8α-（CD4单阳性，SP），CD4 +-CD8α-，（CD8 SP），CD4 +CD8α+（双阳性，DP）和IEL-前体（CD1d-四聚体 - > CD25 - CD4 - CD8α - CD5 + TCRα + CD122 + + H-2K b + PD-1 +或PD-1 + NK1.1 + + <+ sup> + ）T细胞（图1）或B细胞（CD19 + -I-Ab +），树突细胞（CD11c + I-Ab） +）和CD11b + GR-1 +髓样细胞（图2），并且这些组可以根据感兴趣的细胞延伸/取代：小图1：CD1d-四聚体，CD25TCRβ，CD4，CD8α，CD5，CD122，H-2Kβ，PD-1，NK1.1;图2：CD11c，I-Aβ，CD19，CD11b，GR1。
  注意：如果B细胞或骨髓细胞是研究的特定焦点，建议包括Fc受体阻断剂（抗CD16 / 32）。
7. 以524xg（1,500RPM）旋转96孔板，样品5分钟，4℃，弃去上清液，重悬于50μl主混合物中，每5×10 6个细胞细胞。保持在冰上，用铝箔覆盖20分钟。
8. 用200μlFACS缓冲液洗涤样品3次（以524×g（1,500RPM）旋转5分钟，4℃，弃去上清液，重悬于FACS缓冲液中）。
9. 在最后的清洗步骤后，将每个样品重悬于200μlFACS缓冲液中并转移至聚苯乙烯FACS管中。保持在冰上，并用铝箔覆盖，直到采集。
流式细胞术
1. 在流式细胞仪上设置补偿。
2. 获取样本。

数据分析

样品用FlowJo分析。在单重活/死阴性胸腺细胞中，门被设置在IV - 和IV <+>分数上（见图3A）。
未接触或流穿样品的IV分数应与富集样品和血液样品的IV分数比较（图3）。
识别和分析感兴趣的细胞。

图3. IV + 和IV - 单元的门控策略。：一种。在胸腺未接触的（左）或MACS富集的样品（中）内或在胸腺内未鉴定的IV标记的（IV +）或未标记的（IV -s-血（右）。感兴趣的细胞的进一步分析可以用合适的染色小组进行。 B. 3分钟与7分钟静脉注射标记时间在一个实验中进行比较（点图）。图（右）显示未触及（左图）和富集（右图）分数中的中间（IV int ）细胞百分比。 * P ＆lt; 0.05，***

0.001，学生的 t - 测验。每个符号代表一个单独的鼠标。

笔记

作为参考：从6-9周龄的小鼠（主要是女性）中，我们通常获得200-300×10 6个总细胞并恢复1.5-4.5×10 -3个细胞总富集的IV +细胞。在富集的IV +细胞中，我们发现约48.15（±2.52）％TCRβ+ T，2.97（±0.31）％CD19 + T细胞， Ab + B细胞和2.21（±0.54）％CD11b + + GR1 +细胞。另见参考文献Ruscher等人。（2017），图5和Suppl。图4.
对于此协议的第一次使用者，我们建议使用最多三只鼠标。
我们在一次实验中测试了3分钟与7分钟IV标记时间。在我们的手中，标记抗体在胸腺实质中的“泄漏”增加，如由IV分支的PE肩膀所观察到的（参见IV > int在图3B中）。我们建议遵守建议的3分钟标签时间。
我们也在3分钟后立即测试50ml PBS灌注的效果。标记和1分钟异氟醚步骤，并没有观察到有或没有灌注的PVS内细胞类型比例的差异。此外，一些结果表明，灌注可能会影响组织结构的i.v.标签（Anderson ，2014）。
Zachariah 等人。确认了i.v的准确性。用FTY720（作为拮抗剂起作用的S1P的类似物）处理和在RAG-GFP模型（Zachariah和Cyster，2010）中标记胸腺PVS中的CD4 + T细胞。我们比较了T细胞亚群，B细胞和CD11b + GR-1 +细胞在IV IV +，未触及的IV + sup中的百分比（实质）和富IV +级分（Ruscher等人，2017）。我们进一步使用CD24和其他标记物未发表数据，并研究i.v后的％GFP + 和GFP中值荧光强度。标签 Rag2 GFP 。（ Rag2 GFP 指示T细胞受体重组事件后T细胞的年龄，在DP阶段和正选择后GFP荧光高度降低（Boursalian 等人，2004; McCaughtry等人，2007））。差异表明富集的IV +组分不同于血液IV + sup> + 分数，表明该方案主要识别胸腺PVS中的细胞。
除了在我们的PVS标记研究中使用的抗CD45抗体之外，我们和其他人（Zachariah和Cyster，2010; Anderson等人，2014）已经使用了抗CD4（克隆RM4-4， eBioscience;克隆RPA-T4，BD Biosciences）和抗CD8α（克隆53-6.7，eBioscience），用于静脉标记各种外周组织中的血管内容物。
同样，虽然没有专门针对PVS含量标记进行测试，但我们已经使用荧光染料如异藻蓝蛋白（APC）或亮紫色421（BV421）用于静脉注射。周围组织血管相关T细胞的标记。这些荧光染料也可用于鉴定i.v.的胸腺PVS含量。标签。

食谱

FACS缓冲液
补充1 L PBS：
1％FBS
2 mM EDTA
0.02％叠氮钠
ACK裂解缓冲液
补充1 ddH <2> O与：
150mM NH 4 ClCl 10mM KHCO 3
0.1mM EDTA
调整pH值到7.2-7.4
MACS缓冲区
补充1 L PBS：
0.5％BSA
2 mM EDTA

致谢

我们要感谢Rebecca Kummer为某些i.v提供帮助。标记实验和奥斯卡萨尔加多巴雷罗协助拍照。这项工作得到了美国国立卫生研究院授予K.A.H的R37 AI39560和PO1 AI35296的支持。作者没有竞争性的经济利益。

参考

Anderson，KG，Mayer-Barber，K.，Sung，H.，Beura，L.，James，BR，Taylor，JJ，Qunaj，L.，Griffith，TS，Vezys，V.，Barber，DL和Masopust，D 。（2014）。血管内染色鉴别血管和组织白细胞 Nat Protoc < 9（1）：209-222。
Boursalian，T.E.，Golob，J.，Soper，D.M.，Cooper，C.J。和Fink，P.J。（2004）。外围胸腺移居者的持续成熟。 Nat Immunol 5（4）：418-425。
McCaughtry，T.M。，Wilken，M.S。和Hogquist，K.A。（2007）。重新审视胸腺移民。 J Exp Med 204（11））：2513-2520。
Mori，K.，Itoi，M.，Tsukamoto，N.，Kubo，H。和Amagai，T。（2007）。血管周围空间是血液循环和胸腺之间的造血祖细胞和成熟T细胞的通路实质免疫 19（6）：745-753。
Ruscher，R.，Kummer，R.L.，Lee，Y.J。，Jameson，S.C。和Hogquist，K.A。（2017）。 CD8αα上皮内淋巴细胞来自两种主要的胸腺前体。 Nat Immunol 18（7）：771-779。
Weinreich，M.A。和Hogquist，K.A。（2008）。胸腺移植：何时以及如何T细胞离开家。 J Immunol 181（4）：2265-2270。
Zachariah，M.A。和Cyster，J.G.（2010）。神经嵴衍生的周细胞促进皮质髓质连接处成熟胸腺细胞的外出。 >科学 328（5982）：1129-1135。