材料和试剂

2 ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-138）
用于液体细菌培养的灭菌管（Evergreen Scientific，目录号：222-2094-050）
用于细菌接种的一次性1毫升无针注射器（BD，目录号：309659）
12孔细胞培养板（带盖的平底）（Corning，Costar ，产品目录号：3513）
1-200μl移液枪头（Sorenson BioScience，产品目录号：3211）
50-1,250μl移液枪头（Sorenson BioScience，产品目录号：3205）
拟南芥登录Col-0（图1A）
注：拟南芥登录号Col-0携带R基因RPS2，其赋予对Pto DC3000 avrRpt2的抗性（Bent等，1994; Mindrinos等，1994）。
丁香假单胞菌 pv。 DC3000 pVSP61- avrRpt2 （ Pto DC3000 avrRpt2 ）
注意：Pto DC3000 avrRpt2将AvrRpt2效应子传递到植物细胞中，从而在拟南芥Col-0中诱导过敏性细胞死亡。
消毒的超纯水（如emi，Milli-Q）
电导率标准溶液1.41mS / cm（HORIBA，型号：Y071L，目录号：514-22）
抗生素

卡那霉素硫酸盐（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11815032）
利福平（Sigma-Aldrich，目录号：R3501）

细菌蛋白胨蛋白胨3号（BD，目录号：211693）
甘油（Fisher Scientific，目录号：G33-500）
二元磷酸钾（KH 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP363-500）
细菌琼脂（BD，目录号：214010）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A508-P500）
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
King's B液体培养基（见食谱）

设备

步入植物拟南芥生长室（22℃，70％相对湿度和12小时/ 12小时昼/夜光周期）（Conviron，型号：BDR40）
组织培养滚筒转子滚筒用于28°C细菌培养（New Brunswick Scientific，TC-7型）
离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
用分光光度计测定细菌培养物的密度（Beckman Coulter，型号：DU-800）
软木蛀虫（大小4，直径= 7.5毫米）
电解电导率计（HORIBA，型号：B-173）
单通道微量移液器（Eppendorf，20-200μl和100-1,000μl）
高压灭菌器

软件

Microsoft Excel

程序

接种拟南芥与 Pto DC3000 avrRpt2
1. 培养细菌菌株在2毫升King's B液体培养基中，培养基中添加50μg/ ml卡那霉素和50μg/ ml利福平，时间为16-18小时。
  注意：所使用的细菌培养物应该处于生长后期（OD 600 = em = 1.5-2.0）的晚期阶段。
2. 将1毫升液体培养液转移到2毫升微量离心管中。
3. 在室温下3000×g离心5分钟收获细菌。
4. 除去上清液，然后将细菌悬浮在1ml无菌超纯水中。
5. 重复步骤A3-A4。
6. 用灭菌的超纯水调节细菌悬浮液的光密度至OD 600 = 0.1（用分光光度计测量）。
7. 在步入式拟南芥生长室中，将密度调整的细菌悬浮液（Katagiri等，2002）压入渗透到每株植物的两片叶子中。
  注意：使用1毫升无针注射器，通过叶子远轴侧的气孔开口轻轻压入细菌悬液。由于叶子的细胞间隙被细菌悬浮液淹没，渗透区域的外观变成深绿色，叶片的渗透区域很容易看到。
电解电导率的测量

使用纸巾上的软木钻（图1B），从一个植物（每片叶片一片）切下两片叶片（直径7.5毫米）。在步骤A7的浸润的细菌悬浮液从叶片的细胞间隙中干燥之前应该切掉叶盘，其在渗透约20分钟后发生。
注意：我们通常使用在设备部分描述的生长条件下生长的4周龄植物，并选择每株植物的第7叶和第8叶以获得具有可比较发育阶段的叶。选择类似发育阶段的叶子不仅对于每个叶盘具有相似数量的组织是重要的，而且对病原体具有类似的响应。
在步骤B1（图1C）中切下叶盘后立即在12孔板的一个孔中的2ml灭菌的超纯水上漂浮两片叶片（正面朝下）。根据需要测定的植物数量，根据需要使用尽可能多的孔和12孔板。
用盖子覆盖平板并在步入式拟南芥生长室中孵育30分钟。
用2毫升新鲜无菌超纯水替换孔中的水。
注意：步骤B3和B4将去除最初从叶盘边缘的受损细胞泄漏的电解质。
在步入式的拟南芥生长室中孵育平板
在第一次使用电导率标准溶液之前，校准电解电导率计至1.41 mS / cm。
用无菌超纯水清洗电解电导率仪的传感器。
在确定的时间点每孔取100μl水，并使用电导率仪的传感器测量其电导率（图1D）。

图1.测量来自拟南芥叶片的电解质渗漏的实验程序。：一种。在设备部分中描述的生长条件下生长4周大的拟南芥属种Col-0。 B.用纸巾上的软木钻将一张植物（每片一片一片）的两片叶片（7.5毫米直径）切下。 C.在12孔细胞培养板的一个孔中，在2ml无菌超纯水上漂浮两片叶片（正面向下）。 D.用移液管将100μl水从一个孔中滴入电导率仪的传感器并测量其电导率。
。将采样水返回井中，以便在时间过程中保持水量恒定。
继续孵育平板并在更多时间点重复步骤B8-B9。
注意：电导率仪的传感器应在一个样品和另一个样品之间用灭菌的超纯水冲洗。

数据分析

对于数据分析，直接使用从电导率仪的传感器获得的电导率值。我们建议在实验中包含未接种的叶盘作为阴性对照。
注意：数据分析是使用Microsoft Excel完成的。
实验进行至少三次独立的时间，其中每一次都有四到六次生物学复制。为了进行统计分析，使用Student's检验用于两种基因型之间的比较，并且使用单因素方差分析（ANOVA）来比较两种以上的基因型。电解质电导率的提高被解释为细胞死亡的程度（图2）。

图2.细菌接种后2至12小时叶盘中的电解质泄漏。有代表性的叶片电解质泄漏数据。将pto DC3000