材料和试剂

0.2％细菌蛋白胨
0.1％酵母提取物
MgSO 4 4 /
CaCl <2>
Tris（Sigma-Aldrich）
蔗糖（Sigma-Aldrich）
溶菌酶（Sigma-Aldrich）
无EDTA蛋白酶抑制剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：11873580001）
Dnase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
MgCl 2（Sigma-Aldrich）
EDTA（Sigma-Aldrich）
Na HPO ₄
KH ₂ PO ₄
NH 4 Cl
FeSO 4（EDTA螯合物）（Sigma-Aldrich，目录号：F0518）
葡萄糖
球形缓冲液
生长培养基（Rich PYE或Minimal M2G）（参见配方）
球形缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
生长培养基（Rich PYE或Minimal M2G）（参见配方）
蔗糖溶液（见配方）
TEM缓冲液（参见配方）

设备

离心机
蠕动泵（Bio-Rad Laboratories，目录号：731-8140EDU）
高压均化器（Avestin Emulsiflex，EmulsiFlex-C5）
7和15ml Dounce匀浆器（WHEATON）
BECKMAN离心机，定角转子（Ti45或Ti60），旋出转子（SW40）和适当的管子
密度梯度分馏系统（Brandel，型号：BR188）
Beckman超清洁管
SW40转子管

程序

膜的制备
1. 在30℃下在PYE培养基中生长弯曲杆菌，直到OD <660> 为0.6-0.8。
2. 在4℃下以10,000×g离心12分钟，使2L的杆菌属培养物转染。对于所有后续步骤，请保持一切冰。
3. 用球形沉淀缓冲液重悬细胞沉淀。所需的球形化造粒缓冲液的体积（以ml计）= [（OD 660xml培养物体积）/100]×7。例如， 660的0.8将由112ml球化缓冲液重悬浮
4. 加入100mg/ml溶菌酶（溶解在球形造粒缓冲液中）。在冰上放置2分钟。对于在M2G基本培养基中生长的培养物，使用较少的溶菌酶（50mg/ml），因为在这些条件下生长的细胞具有较弱的细胞壁。 M2G最小培养基可用于检查由于碳饥饿导致的外膜蛋白的差异表达
5. 加入1片蛋白酶抑制剂混合物，25μg/ml Dnase I（终浓度）和10mM MgCl 2（终浓度）。
6. 加入2体积的冷裂解缓冲液的细胞。这必须缓慢进行，以避免局部细胞裂解。以4-6 ml/min的速率加入裂解缓冲液，用移液管或使用蠕动泵滴加。在加入裂解缓冲液期间，细胞溶液必须不断涡旋以避免局部裂解
7. 使用均匀化压力设置为〜12,000-15,000psi用Avestin Emulsiflex完全裂解细胞。
8. 颗粒不溶碎片在10,000×g下，在4℃下20分钟。收集上清液（含膜）。
9. 使用Ti45转子（36,000rpm，1.5h，4℃）在Beckman超速离心机中旋转上清液。旋转后，保留膜沉淀并弃去上清液
10. 为了洗涤膜，将膜沉淀重悬在50-100ml球化缓冲液中并重复步骤9.向洗涤步骤中的球化缓冲液中加入1x蛋白酶抑制剂混合物是可选的。
11. 使用〜6-7ml的25％蔗糖（w/v）重悬浮膜沉淀。向蔗糖溶液中加入1x蛋白酶抑制剂混合物是可选的，但不是必需的
细胞膜分级
1. 使用Beckman Ultra-Clear管制备蔗糖梯度。使用Beckman管（14 x 95 mm）作为SW40转子。蔗糖梯度由各自为1.7mL的60,55,50,45,40,35,30％蔗糖组成。为了倾倒蔗糖梯度，将每种蔗糖浓度所需的体积移至埃彭道夫管中。使用塑料巴斯德吸管，将60％蔗糖溶液从eppendorf管转移到超透明管的底部。将超透明管保持在45°角，然后通过在60％蔗糖溶液附近缓慢地逐滴加入来转移55％蔗糖溶液。然后加入50,45,40,35和30％蔗糖。我发现这个特定的方法最小化了对渐变的破坏
2. 在蔗糖梯度上加入约1.2ml膜样品（来自步骤10）。确保蔗糖梯度管与SW40转子管平衡。
3. 在SW40转子中以34,000rpm，4℃旋转蔗糖梯度40小时，以通过平衡沉降分离膜。使用缓慢断裂，以保持蔗糖梯度。
4. 梯度应该具有黄棕色区域（内膜）和多云白色区域（外膜）。使用Brandel/Foxy Jr分级器和2M蔗糖（在5mM EDTA，pH7.5）作为置换液分离0.5ml级分。或者，从梯度的顶部收集0.5ml级分。级分9-12通常含有内膜，级分16-18含有总计约23个级分的外膜。为了证实，使用针对内膜蛋白和外膜蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析（参见下图，显示20μl的每个级分用于SDS-PAGE和通过考马斯分析;和5μl的每个级分通过使用我们的家兔抗体）。
5. 冷冻液体N 2中的馏分并储存在-80℃。为了进一步分析，将相关级分汇集并在TEM缓冲液中洗涤，然后将膜重悬浮在所选择的缓冲液中。洗涤，用至少5体积的TEM缓冲液混合级分，并在Beckman超速离心机（36,000rpm，1.5小时，4℃）中旋转。
  
  图1.野生型 C的膜。 crescentus 在蔗糖梯度上分级并通过SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色（上图）揭示了内膜蛋白TimA和外膜蛋白BamA的膜蛋白质图谱和免疫印迹分离（下图）。

食谱

生长培养基（富PYE或最小M2G）
PYE（胨酵母提取物）肉汤
0.2％细菌蛋白胨 0.1％酵母提取物
1mM MgSO 4 0.5mM CaCl 2·h/v M2G（以葡萄糖为唯一碳源的M2最小盐培养基）
6.1mM Na 2 HPO 4
3.9mM KH 2 PO 4 sub/
9.3mM NH 4 Cl/s 0.5mM MgSO 4 10μMFeSO 4（EDTA螯合物）
0.5mM CaCl 2·h/v 0.2％葡萄糖
球形缓冲液
10mM Tris（pH7.5） 0.75 M蔗糖
裂解缓冲液
1.5mM EDTA（pH7.5）
蔗糖溶液
25％蔗糖（w/v）的5mM EDTA（pH7.5）中 60,55,50,45,40,35,30％（w/v）蔗糖的5mM EDTA（pH7.5）中的溶液。
2 M蔗糖置换液进行分馏
TEM缓冲区
10mM Tris（pH7.5） 1mM EDTA
10mM MgCl 2/
10％甘油

致谢

作者承认Trevor Lithgow教授和Xenia Gatsos博士的帮助和支持。

参考文献

Anwari，K.，Poggio，S.，Perry，A.，Gatsos，X.，Ramarathinam，SH，Williamson，NA，Noinaj，N.，Buchanan，S.，Gabriel，K.，Purcell，AW，Jacobs-Wagner ，C。和Lithgow，T。（2010）。在α-变形杆菌属新月柄杆菌外膜中的模块化BAM复合物。 PLoS One 5（1）：e8619。
Anwari，K.，Webb，CT，Poggio，S.，Perry，AJ，Belousoff，M.，Celik，N.，Ramm，G.，Lovering，A.，Sockett，RE，Smit，J.，Jacobs-Wagner ，C。和Lithgow，T。（2012）。细菌外膜BAM复合物的新脂蛋白亚基的进化。 Mol Microbiol 84（5）：832-844。