材料和试剂

物料
1. 提示（1,000μl，200μl，10μl）（Tarsons）
2. 无菌培养皿（HiMedia Laboratories，目录号：PW001）
3. 锥形瓶和烧杯（SchottDuran，10毫升，250毫升，500毫升）
4. Eppendorf管（Tarsons，1.5毫升，2.0毫升）
5. 金属环固定器（金属环Ch-2，HiMedia实验室，目录编号：LA012）
6. L形撒布机（HiMedia Laboratories，目录号：PW1085）
诱变剂
1. 叠氮化钠（HiMedia Laboratories，目录号：GRM1038）
2. 4-硝基喹啉氧化物（Sigma-Aldrich，目录号：N8141）
3. 2-氨基芴（Sigma-Aldrich，目录号：A55500）
4. 苯并[a]芘（Sigma-Aldrich，目录号：B1760）
5. 丝裂霉素C（Roche Diagnostics，目录号：10107409001）
6. 2,4,7-三硝基-9-芴酮（Accustandard，目录号：R-033S）
7. 4-硝基 - 苯二胺（Sigma-Aldrich，目录号：108898）
试剂
1. 2号Oxoid营养肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：70123）注意：此产品已停产。
2. 70％乙醇
3. 硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：RM683）
4. 柠檬酸一水合物（HiMedia Laboratories，目录号：GRM1008）
5. 磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（无水）（Merck，目录号：61788005001730）
6. 磷酸四氢铵（NaNH 4 HPO 4·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9506）
7. D-生物素（HiMedia Laboratories，目录号：TC096）
8. L-组氨酸（HiMedia Laboratories，目录号：TC076）
9. 盐酸（HCI）（HiMedia Laboratories，目录号：AS003）
10. 氯化钾（KCl）（Merck，目录号：61753305001730）
11. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：MB040）
12. 磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）（Merck，目录号：1063700050）
13. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（HiMedia Laboratories，目录号：TC051）
14. NADP（钠盐）（HiMedia Laboratories，目录号：RM392）
15. D-葡萄糖-6-磷酸盐（单钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号：G7879）
16. 氨苄青霉素三水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A6140）
17. 氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：106462）
18. 结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C6158）
19. 琼脂（Himedia Laboratories，目录号：RM026）
20. 营养肉汤（HiMedia实验室，目录号：M002）
21. 四环素（Sigma-Aldrich，目录号：87128）
22. 二甲基亚砜（HiMedia Laboratories，目录号：TC185）
23. Vogel-Bonner中型E（50x）（见食谱）
24. 0.5 mM组氨酸/生物素溶液（见食谱）
25. 盐溶液（1.65M KCl + 0.4M MgCl 2）（见食谱）
26. 0.2 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4（见食谱）
27. 1 M烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）溶液（见食谱）
28. 1 M葡萄糖-6-磷酸盐（见食谱）
29. 氨苄青霉素溶液（4毫克/毫升）（见食谱）
30. 结晶紫溶液（0.1％）（见食谱）
31. 最小的葡萄糖板（见食谱）
32. 组氨酸/生物素平板（见食谱）
33. 氨苄青霉素和四环素*板（见食谱）
34. 营养琼脂平板（见食谱）
35. S9混合物（大鼠肝微粒体酶+辅因子）（见食谱）
36. 叠氮化钠（见食谱）
37. 丝裂霉素（见食谱）
38. 2-Anthramine（见食谱）

设备

轨道振荡培养箱（Remi，型号：RIS-24（BL））
层流罩（生物安全柜）（Deepak Meditech Pvt Ltd.，Steri clean）
移液器（Eppendorf，型号：Research plus plus，目录号：3120000062,1000μl;目录号：3120000046,200μl;目录号：3120000020,10μl）。
涡旋混合器（Labnet International，目录号：S0100）
热水浴（Daiki Sciences，目录号：KBLee2001）
高压灭菌器（TSC）
自动菌落计数器（声纳）
冰箱离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus Biofuge Primo R）
pH计（Labindia Analytical Instruments，型号：PICO pH计，目录号：PC13330101）
组织分娩器（Bio Spec Products，产品目录号：985370-04）

程序

在进行实验之前，接种一株标准品系的新鲜菌落。鼠伤寒沙门氏菌TA 98,100和102在牛痘营养肉汤-2中培养10-12小时，并在37℃下在培养摇床中在120rpm下培养以确保充足的1×10 -9 /细菌细胞。每个S的菌株。
在锥形瓶（10毫升）中单独生长鼠伤寒杆菌
为每个实验准备新鲜的诱变剂（见食谱）。
阴性对照：蒸压蒸馏水
没有S9代谢活化（S9混合）的TA 98，TA 100和TA 102的阳性对照：叠氮钠（1μg/ ml）2-硝基氟（1μg/ ml）和丝裂霉素（0.125μg/ ml）
对于具有S9代谢活化（S9混合）的TA 98，TA 100和TA 102：2-Anthramine（2μg/ ml）
最小葡萄糖琼脂（MGA）平板的制备：混合最小葡萄糖琼脂平板的培养基（配方9）并将25ml倒入每个培养皿中。使用前准备新鲜的盘子。
在实验前标记所有最小葡萄糖琼脂平板和Eppendorf管。
向2毫升无菌Eppendorf管中添加以下各项：
1. 0.1ml新鲜培养的沙门氏菌菌株
2. 0.2毫升His / Bio解决方案
3. 0.5ml磷酸钠缓冲液（不含S9混合物）或0.5ml S9（存在S9混合物）
4. 0.1毫升的测试样品或0.1毫升的阳性或阴性对照
5. 用高压灭菌蒸馏水补充1毫升
将Eppendorf管的内容物混合并倒入Petri板中，并使用L形扩散器涂布在MGA板的表面上。
使用无菌铝箔覆盖培养皿，以保护测试样品不受光反应物质影响。
在37℃孵育48小时后，出现自发回复菌落，并且用肉眼清楚可见。所有板块都重复运行三次。
回归物在表面背景下形成一个统一的营养缺陷型细菌草坪。

数据分析

非统计分析
对于Ames检验结果的非统计分析最广泛使用的方法是Mortelmans和Zeiger（2000）和Morino-Caniello和Piegorsch（1996）描述的“双重规则”。根据回复菌落数量的增加，受试样品浓度升高（剂量依赖性方式），首先通过计算每个平板的回复菌落数目计算致突变性比率（MR），然后计算MR如Maron和Ames（1983）所述，使用以下公式（见下面的样本数据获得结果）：

示例数据
医疗液体废物是从斋浦尔市的不同医疗保健场所收集的。使用Maron和Ames，1983年描述的平板掺入程序对所有样品进行沙门氏菌致突变性测试。通过诱变性比率法分析沙门氏菌致突变性测定的结果，并在表中显示4.

表4.使用来自不同健康场所的废水处理的鼠伤寒沙门氏菌菌株TA98，TA100和TA102的致突变性比率（Vijay，2014）

+致突变性比率＆gt; 2.0意味着诱变，-Ratio < 2.0意味着非诱变

结论
艾姆斯试验是一种广泛接受的细菌检测法，用于检测致病菌的致突变性。在该协议中，尽管我们已经显示了用于执行适用于三种菌株的艾姆斯试验的逐步方法，但是该方法可以用于研究所有化合物以推断诱变性。鉴于艾姆斯分析实验涉及无菌措施，必须小心确保样品/质粒未被污染。检测化合物遗传毒性的改进方法有助于我们诊断研究临床试验中所用化合物的方法。

笔记

灭菌（与沙门氏菌处理时的安全考虑）

作为 S。鼠伤寒沙门氏菌是一种致病菌，每次使用预防措施都是谨慎的，并应用标准的生物安全指导方针，例如使用堵塞式移液器，70％乙醇进行适当的灭菌以及对所有污染物质进行高压灭菌。
化学品和菌株的处理应在生物安全柜中进行。使用前后，柜子必须使用70％乙醇灭菌，并暴露于15分钟的紫外线。
穿着长袍，眼镜和手套，必须注意防止化学品暴露
在丢弃之前，应对所有受污染的材料（例如，试管，移液器和移液器吸头，长袍和手套）进行适当的高压灭菌。

的限制

艾姆斯试验由鼠伤寒沙门氏菌菌株组成，因此它不是人类的完美模型。小鼠肝脏S9肝脏级分用于最小化在肝脏系统中形成的哺乳动物代谢激活，从而可以评估代谢物的致突变性。人和小鼠新陈代谢之间有几个不同之处，可能会影响检测物质的致突变性。波动测试的主要缺点比Ames协议更慢，更费力。该测试主要用于测试含有低水平诱变剂的含水样品，因此，该测试适用于评估废水样品的致突变性。

食谱

Vogel-Bonner中型E（50x）
用于最小琼脂（配方9）

成分

每500毫升

温热蒸馏H 2 O（45°C）

335毫升

硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）

5毫克

柠檬酸一水物

50毫克

磷酸钾，二元（无水）（K 2 HPO 4）

250毫克

磷酸铵钠（NaNH 4 HPO 4·4H 2 O）

87.5毫克

将盐加入烧瓶中的温水中。将烧瓶放在热板上
每种盐完全溶解后，将溶液转移到玻璃瓶中并在121℃高压灭菌20分钟。
当溶液变凉时，紧紧盖住瓶子
将溶液储存在4°C

0.5 mM组氨酸/生物素溶液
用于诱变生物分析

成分

每125毫升

D-Biotin（F.W. 247.3）

15.45毫克

L-组氨酸·HCl（F.W.191.7）

12.0毫克

蒸馏水 O O

125毫升
将生物素溶于热蒸馏水中。该溶液在121℃高压灭菌20分钟，然后在4℃下保存。

盐溶液（1.65M KCl + 0.4M MgCl 2）
对于S9肝脏部分

成分

每250毫升

氯化钾（KCl）

30.75毫克

氯化镁（MgCl 2·6H 2 O）

20.35毫克

蒸馏H 2 O至终浓度为

250毫升
所有组分都溶于水中。该溶液在121℃高压灭菌20分钟，然后在4℃下保存。

0.2 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4
对于S9肝脏部分

成分

每250毫升

0.2M磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4·2H 2 O）

30毫升（6.9毫克/ 250毫升）

0.2M磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）

220毫升（7.1毫克/ 250毫升）
调整pH值到7.4。
在121℃高压灭菌20分钟以消毒缓冲液

1 M烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）溶液
对于S9肝脏部分

成分

每2.5毫升

NADP

191.5毫克

无菌蒸馏H 2 O

2.5毫升
将NADP溶解在蒸馏水中并通过涡旋混合。管放置在冰浴中。该解决方案可以使用长达六个月

1 M葡萄糖-6-磷酸
对于S9肝脏部分

成分

每5毫升

葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）

1.41毫克

无菌蒸馏H 2 O

5毫升
将葡萄糖-6-磷酸溶于5ml蒸馏水中并通过涡旋混合。管放置在冰浴中。该解决方案可以使用长达六个月

氨苄青霉素溶液（4毫克/毫升）
用于耐氨苄西林的试验
R因子菌株的主板

成分

每500毫升

氨苄西林三水合物

0.4毫克

氢氧化钠（0.02 N）

50毫升
将氨苄青霉素三水合物溶于50ml NaOH（0.02N）中并通过涡旋混合。管被放置在冰浴

结晶紫溶液（0.1％）
用于结晶紫灵敏度测试（确认rfa突变）

成分

每500毫升

结晶紫

0.05毫克

蒸馏水 O O

50毫升

最小的葡萄糖平板
用于诱变生物测定

成分

每500毫升

琼脂

7.5毫克

蒸馏水 O O

465毫升

50倍VB盐（配方1）

10毫升

40％葡萄糖

25毫升
在465ml蒸馏水中加入琼脂，并在121℃高压灭菌20分钟。冷却后，轻轻加入盐和葡萄糖

组氨酸/生物素平板（非R因子菌株的主平板）
用于测试组氨酸需求量

成分

每500毫升

琼脂

7.5毫克

蒸馏水 O O

457毫升

50倍VB盐

10毫升

40％葡萄糖

25毫升

无菌组氨酸（每400毫升H 2 O 2克）

5毫升

无菌0.5 mM生物素

3毫升
将琼脂溶于蒸馏水中的给定浓度。分别高压灭菌每个溶液20分钟。溶液冷却后，轻轻加入每种盐

氨苄青霉素和四环素*平板
用于培养含有质粒pKM101和pAQ1 *的菌株的主盘

成分

每500毫升

琼脂

7.5毫克

蒸馏水 O O

405毫升

50倍VB盐

10毫升

40％葡萄糖

25毫升

无菌组氨酸（每400毫升H 2 O 2克）

5毫升

无菌0.5 mM生物素

3毫升

无菌氨苄青霉素溶液（8 mg / ml 0.02 N NaOH）

1.58毫升

*无菌四环素溶液（8 mg / ml 0.02 N HCl）

0.125毫升
将琼脂溶于蒸馏水中的给定浓度。分别高压灭菌每个溶液20分钟。溶液冷却后，轻轻加入每种盐
注意：TA 102对四环素有抗性。 4°C时板的保质期为两周。

营养琼脂平板
用于检测基因型[结晶紫灵敏度（rfa）和紫外敏感度（AuvrB）]和细菌存活率

成分

每500毫升

营养琼脂

7.5毫克

蒸馏水 O O

500毫升
将琼脂溶于蒸馏水中的给定浓度。分开高压灭菌20分钟。将冷却后的溶液倒入培养皿中

S9混合（大鼠肝微粒体酶+辅因子）

成分

标准S9混合每25毫升

小鼠肝脏

1.0毫升（2％）

MgCl 2 -KCl盐

0.5毫升

1 M葡萄糖-6-磷酸

0.125毫升

0.1 M NADP

1.0毫升

0.2 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4

12.5毫升

无菌蒸馏H 2 O

9.86毫升
注意：按照上面列出的相反顺序加入每种成分（先加水，然后加磷酸盐缓冲液...）。避免重新凝固S9混合物。

叠氮钠
用于诱变试验

成分

每毫升

叠氮钠

10微克

高压灭菌器蒸馏H 2 O

990μl（使总体积为1 ml）
通过服用1,2,4μl10 mg / ml
制备工作浓度

2-Nitrofluorine
用于诱变试验

成分

每毫升

2-Nitrofluroine

10微克

高压灭菌器蒸馏H 2 O

990μl（使总体积为1 ml）
通过服用1,2,4μl10 mg / ml
制备工作浓度

丝裂霉素
用于诱变试验

成分

每毫升

丝裂霉素

10微克

高压灭菌器蒸馏H 2 O

990μl（使总体积为1 ml）
通过服用1,2,4μl10 mg / ml
制备工作浓度

2-Anthramine
用于诱变试验

成分

每毫升

2-Anthramine

10微克

高压灭菌器蒸馏H 2 O

990μl（使总体积为1 ml）
通过服用1,2,4μl10 mg / ml
制备工作浓度

致谢

Urvashi Vijay想感谢工作进行的斋浦尔IIS大学动物学系。感谢由2012/9389年度国际友好协会奖学金获得给Urvashi Vijay的资助。
利益冲突：没有声明。
作者贡献： Urvashi Vijay，Sonal Gupta，Priyanka Mathur在Pradeep Bhatnagar的指导下执行协议和方法。 Prashanth Suravajhala在所有作者批准之前重新审查了作品并对原稿进行了校对。

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