材料和试剂

Verex TM小瓶试剂盒，9mm，螺旋盖，聚丙烯，300μl+ PTFE /硅胶帽，蓝色，1,000 /包（Phenomenex，目录号：AR0-9991-13）
具有20毫米卷曲顶部涂饰的透明玻璃血清瓶，10毫升，100 /盒（DWK Life Sciences，WHEATON，目录号：225278）
Curwood Parafilm M TM实验室包装膜（Bemis，目录号：PM996）
Costar Microcentrifuge Tubes 0.65 ml，500 /袋（Corning，目录号：3208）
Onyx Monolithic C18色谱柱，100 x 2 mm（Phenomenex，目录号：CH0-8467）
备选色谱柱（详见说明）：Onyx Monolithic C18色谱柱，100 x 3 mm（Phenomenex，目录号：CH0-8158）
模型1701和1702小型注射器，10μl（26s规格）和25μl（22s规格），2“针形式2（汉密尔顿，目录号：80030和80230）
无衬铝开顶密封，20 mm，1,000 /箱（DWK Life Sciences，WHEATON，产品目录号：224178-05）
20毫米塞子，直塞，超纯（DWK Life Sciences，WHEATON，目录号：W224100-405）
200μl移液吸头（VWR，目录号：53508-810）
液氮
纯化的铁氧化还原蛋白（Fd）在50mM乙酸铵缓冲液（pH6.8）中于H 2 O（储存浓度150μM）中来自Pf
注意：用1N HCl调节pH值。
在20mM Tris，150mM NaCl缓冲液（pH8）中在H 2 O（储备浓度16.5mg / ml）中纯化NADH依赖性铁氧还蛋白-NADP +氧化还原酶（Nfn）来自生物体 Pyrococcus furiosus （ Pf ）
注意：用1N HCl调节pH值。
连二亚硫酸钠（Merck，目录号：1065051000）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +，Cayman Chemical，目录号：16077,500mg）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，Cayman Chemical，目录号：16078,500mg）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +，Cayman Chemical，目录号：10004675,50mg）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，Cayman Chemical，目录号：9000743,25mg）
99.5％甲酸（Fisher Scientific，目录号：A117-50）
来自猪胃粘膜的胃蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P6887-1G）
醋酸钠三水合物（Fisher Scientific，目录号：S607-500）
乙酸铵，≥99％（Sigma-Aldrich，目录号：09689-250G）
37％盐酸（= 12.1M）（Merck，目录号：HX0603-3）
氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：BP359-500）
氧化氘（Sigma-Aldrich，目录号：151882-100G）
Tris碱（Merck，目录号：648311-5KG）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP358-212）
HPLC级水（Fisher Scientific，目录号：W5-4）
HPLC级乙腈（Fisher Scientific，目录号：A998-4）
Nanopure水（使用Millipore Q-Gard 2内部纯化）
Tris碱，在氧化氘中的NaCl缓冲液（pH7.0）（见食谱）
Tris碱，NaCl缓冲液（pH7.0）在H 2 O（参见配方）中
Tris碱，NaCl，连二亚硫酸钠缓冲液（pH 7.0）在H 2 O中的溶液（参见食谱）。

设备

用于分离通过胃蛋白酶消化产生的肽的HPLC叠层（例如，Agilent Technologies制造的1290 Infinity系列HPLC叠层）（Agilent Technologies，型号：1290 Infinity系列）
用于样品分析/数据采集的LC / MS Q-TOF系统（Agilent Technologies制造的6538UHD Accurate-Mass Q-TOF LC / MS）（Agilent Technologies，型号：6538UHD Accurate-Mass Q-TOF LC / MS）
手套箱能够在正的惰性气体压力下保持厌氧条件（例如，MBraun，型号：UNIlab Plus手套箱工作站）
氮气罐
20毫米用于铝密封的Kebby标准卷曲机（医学实验室供应，目录号：2001-00-C01A）
Fisher Scientific isotemp 110水浴（Fisher Scientific，型号：Fisherbrand TM TM Isotemp TM，目录号：S63077Q）
注意：此产品已停产。
Milli-Q纯化系统（Merck，目录号：QGARD00D2）
移液器（10μl和100μl）（Eppendorf，目录号：022478886和022478924）

软件

在Windows 7上的Microsoft Excel 2016
UCSF Chimera v。1.11.2
MassHunter工作站软件定性分析v.06.00（安捷伦科技）
HDExaminer v。1.3.0 beta 6（Sierra Analytics，Inc.）
MassHunter工作站软件用于6200系列TOF / 6500系列Q-TOF v。B.05.01（Agilent Technologies）的LC / MS数据采集
肽分析工作表免费版（PAWs，ProteoMetrics免费版）
SearchGUI v。3.2.18（Compomics）
Peptide Shaker v。1.16.9（Compomics）

程序

反应制备
1. 在制备储备溶液和反应混合物之前，确定时间点的数量。时间点的数量决定了反应混合物的体积。对于每个时间点，10μL必须可用于添加淬火溶液，再加上10μL的24小时/完全氘化时间点。例如，在Nfn的HDX实验中，测量了五个时间点（1分钟，3分钟，15分钟，60分钟，3小时和24小时）（Berry等人，2018年）。包括额外的10μl反应溶液以防止全部反应溶液的排出，从而使总体积达到70μl。
  注：选择时间点以提供快速，中等和慢速交换残基的数据。跨多个时间尺度的数据有助于更深入地解释结果。尽管短时间点对于蛋白质动力学可能非常有用，但应注意留出时间从反应室取出样品并以可重现的方式进行淬灭。
2. 在厌氧条件下制备储备溶液和反应混合物，使用由设置为40PSI的氮气罐供料的MBraun手套箱。保持氮气正压，维持手套箱内的无氧环境。确切的气体流量取决于具体的设置，但手套箱内的气体传感器监测条件应记录0 ppm O 2和H 2 O，
  2毫巴的压力
3. 在MBraun手套箱中，通过将30μlNfn加入一个Verex小瓶中，并将10μlNfn加入另一个Verex小瓶中，准备两个纯化的Nfn（储备浓度16.5mg / ml）的厌氧等分试样。然后将纯化的Fd以1:1的摩尔比加入到10μl的Nfn等分试样中。使用双瓶系统，盖上Verex小瓶，并置于透明玻璃血清小瓶内，其中含有1ml连二亚硫酸钠的脱气Tris-HCl缓冲液，并使用卷曲机密封。从手套箱中取出密封的小瓶，用Parafilm包裹，并在反应开始前储存在4°C。
  注意：在玻璃血清瓶中只加入1毫升含还原剂的缓冲液。任何更大的体积都会导致Verex小瓶轻微浮动，使得在指定的时间点很难取出样品。
4. 用下列组合中的每种吡啶核苷酸1mM制备氘化缓冲液：NAD +，NADH，NADP +，NADPH，NADH + NADP + ，NADPH + NAD + 。另外准备一个不含吡啶核苷酸的相同缓冲液的另外的储备物来测试Nfn:Fd复合物。
  注意：制备5ml的氘化缓冲液储备液，随后用每种核苷酸组合物等分出来以制备每种条件的500μl储液以用于建立反应混合物。对于一式三份的情况，500μl应该具有足够的体积以建立反应混合物。这些体积可以/应该改变，具体取决于测试条件和时间点的数量。
5. 首先在Schlenk生产线上使用四个10分钟的循环对氘化缓冲液脱气来制备反应瓶。 Schlenk生产线通过在真空中除去氧气和用氮气将溶液置于正压下进行交替运转。脱气后，将反应溶液转移到手套箱中。
6. 将63μl的每个反应缓冲液放入三个Verex小瓶中，盖上，放入透明玻璃血清小瓶中，并使用卷曲机密封。该体积的缓冲液适用于所有时间点的体积，同时也为蛋白质的添加留出空间。密封反应瓶，从手套箱中取出，在室温下储存，然后开始反应。
7. 为每个时间点准备一个淬灭溶液，并在反应前和反应过程中将溶液保存在冰上。通过将1％甲酸（45μl）和猪胃蛋白酶（15μl1mg / ml在50mM乙酸钠pH 4.5中（H 2 O; pH设定为0.1）在Costar微量离心管中制备溶液N HCl）;终浓度：0.2mg / ml）。胃蛋白酶的最终浓度在有限的消化时间内给出足够的靶蛋白覆盖率（〜100％）。用10μl反应缓冲液制备单独的淬灭溶液以测试溶液的pH。
  HDX淬火的目标pH值为2.5 注意：
  1. 淬火解决方案不需要厌氧准备，因为此时反应已结束。
  2. 在低PH值淬火条件下，蛋白质的胃蛋白酶消化将交换位置定位到蛋白质的某些区域。
氢氘交换反应
1. 通过使用气密Hamilton注射器将1:10（v / v）稀释液加入氘化缓冲液中（这导致最终Nfn浓度为1.6mg / ml）开始HDX反应。这确保了D 2 O是主要的溶剂物质。描绘HDX反应步骤的工作流程如图1所示。
  注：Nfn的反应在60°C下进行。通过Fisher Scientific isotemp 110水浴对此温度进行调节。选择该温度是为了模拟有机体Pyrococcus furiosus居住的高温条件。
2. 在特定的时间点（对于该反应：1分钟，3分钟，15分钟，60分钟，3小时和24小时），使用不透气的汉密尔顿注射器移除10μl反应混合物，并添加至骤冷溶液（pH 2.5,0℃;淬灭溶液中Nfn的浓度：约0.23mg / ml）。
  注意：
  1. 这阻止了交换反应，因此低pH值，温度或氧气暴露对蛋白质造成的任何破坏都不会影响数据解释。
  2. 胃蛋白酶消化可以进行2分钟，然后在液氮中快速冷冻溶液并储存在-80℃。
    
    图1. HDX-MS样品制备和工作流程。使用双瓶系统使样品保持厌氧，其中将所有反应组分加入到小型螺帽小瓶中，将其在厌氧下密封在稍大的透明玻璃卷曲小瓶中。使用气密Hamilton注射器将蛋白质注入反应混合物以引发反应。在指定的时间点，从反应混合物中提取10μl样品，并将其加入到含甲酸和猪胃蛋白酶的好氧急冷溶液中。酸不仅锁定了交换到蛋白质上的任何氘，还用于部分变性蛋白质复合物，使其更容易被胃蛋白酶消化。暴露于氧气后会发生额外的展开。消化2分钟后，将样品在液体N 2中快速冷冻并储存在-80℃直到在Agilent 6538Q-TOF上获得数据。采集后，处理数据以显示吸收曲线形式的氘摄取随时间推移。通过将氘掺入蛋白质的3D结构（如果有的话），氘掺入可以定位在蛋白质的结构上。
数据采集和处理
1. 使用Onyx单片C18柱，使用以下梯度的A（H 2 O，0.1％甲酸）和B（ACN，0.1％甲酸）溶剂在10分钟内进行液相色谱：0.0-1.0分钟，5％B; 1.0-9.0分钟，5-45％B; 9.1-9.8分钟，95％B; 9.8-9.9分钟，5％B.将流速设定为500μl/分钟。注入10μl，导致在柱上注射大约2.3μg蛋白质。在数据采集之前和数据采集过程中，将LC瓶保存在冰上保持溶剂冷却（〜0°C）。此外，将色谱柱室温设置为1°C，并将自动进样器温度设置为4°C，以帮助样品在注入质谱仪之前保持较低的温度。
  注意：
  2. 本协议中使用的HPLC堆栈不允许自动进样器中的较低温度和柱室中较低的温度不稳定，这可能导致数据的变化。
2. 对于使用MassHunter工作站软件操作的Agilent 6538 Q-TOF上的数据采集，以正模式扫描范围为50-1,700 m / z的2 Hz采集扫描。将电喷雾设置设置为：3.7巴的雾化器气体，8.0 L / min的干燥气体，350°C的干燥温度，3.5 kV的毛细管电压，并将采集模式设置为MS（seg）。
  注意：Agilent Technologies为新用户提供其软件的详细信息。有关包括Masshunter在内的不同软件选项的更多信息，请参阅Agilent Technologies网站（安捷伦软件：软件与信息学）。
3. 在Agilent MassHunter定性分析中使用以下设置通过分子特征识别质谱中的化合物：提取算法目标数据类型，小分子;峰值滤波器，≥500个计数;离子种类，+ H和+ Na;同位素分组，峰间距公差0.0025μm/ z + 7.0ppm，同位素模型：肽;充电状态分配限制为最多5个。
  注意：这也是一个很好的机会来查看数据，并在质谱中查找发生氘交换的迹象（这也可以在数据采集过程中完成）。在非氘代样品中找到肽的同位素包膜。然后观察氘代样品中的相同保留时间，以确定同位素分布是否发生了变化。如果有的话，实验工作，否则，确定为什么交换不起作用，或为什么回流交换发生造成氘离子的损失是至关重要的。图2A中可以看到示例性的同位素比较。
  
  图2. HDX-MS数据的同位素分布和摄取曲线。：一种。来自Nfn-L的肽的同位素分布转变的例子。随着交换时间增加（0-180分钟），由于添加了氘，质心向右移动，如红色虚线所示。 B.显示四种测试条件下氘掺入的吸收曲线。该数据适用于Nfn-L的残基124-144，该氨基酸序列位于摄取曲线上方。
4. 为蛋白质样品的非氘化摘要创建化合物列表，并将其作为复合摘要CSV（.csv）导出并导入到Microsoft Excel 2016中。
5. 在两步过程中使用化合物总结列表来鉴定胃蛋白酶消化产生的肽。
  注意：
  1. 第一步确定用质谱法检测到的独特肽。这些质量只与Nfn的序列匹配，同时也落在质量误差容限内。
  2. 第二步是通过收集碎片数据对肽进行测序来确定包含多个肽匹配的质量在误差容限内的特性。
6. 将蛋白质序列置于PAW中以使用胃蛋白酶切割位点产生理论切割图并且误差为100ppm以解释胃蛋白酶切割的非特异性质。
  注：胃蛋白酶切割位点在以下残基之后：L，W，I，A，F，Y，N，T，C，V，S，Q，G，E，D，R，M，K， H和P.裂解位点是根据PeptideShaker程序提供的输出进行选择的。
7. PAW为目标蛋白复合物中存在的每个亚基鉴定独特的肽。独特的多肽是那些在设定的误差容限（100 ppm）内只与Nfn序列匹配的那些肽。
  在Excel电子表格中添加每个独特的肽以及相应的序列，电荷和保留时间。
  注意：
  1. 在容错范围内排除具有多个匹配的任何质量。
  2. 视频1显示了如何设置PAW以识别独特的多肽。
8. 将肽列表保存为逗号分隔（.csv）文件。
  
  s视频1
肽碎片数据采集和处理
1. 几种肽可具有相同的m / z，因此为了成功鉴定这些肽片段，在Agilent 6538 Q-TOF仪器上收集数据。在数据采集扫描范围（50-1,700m / z）范围内，用于碎裂的碰撞能量设置为4V至68V范围内的梯度。
  注意：除了设置为自动MS / MS（seg）的数据采集模式之外，所使用的HPLC和MS设置与先前在过程C，步骤1和2中所讨论的相同。
2. 打开Masshunter定性分析软件中的数据文件，使用命令“通过自动MS / MS查找”来识别碎片特征。然后将数据文件导出为Mascot通用文件（.mgf）。
3. 使用SearchGUI根据碎片数据识别肽段。
  1. 要设置SearchGUI，首先定义蛋白质序列。对于这个实验，使用来自火球菌的Nfn小亚基和大亚基的序列。 SearchGUI会要求制作诱饵序列，这有助于识别误报。
  2. 接下来，设置SearchGUI的搜索参数。对于这个实验使用以下设置：消化：酶;酶：胃蛋白酶A;特异性：半特异性;最大错过的劈理：5;片段离子类型：b和y;前体 m / z 公差：20 ppm;片段 m / z 公差：20 ppm;前体充电：1-5;同位素：0-1。
  3. 选择输出文件夹以及搜索引擎。对于这个实验，选择X！Tandem，MyriMatch和MS Amanda进行多肽搜索。
  4. 选择PeptideShaker进行后期处理。 PeptideShaker提供了一个易于遵循的片段离子鉴定输出，并提供了识别肽段的序列，m / z和保留时间。
  5. 将从碎裂数据中鉴定的肽与在PAW中鉴定的独特肽组合。已识别肽的组合列表保存为.csv文件，并用作氘合并计算的输入文件。
    注意：视频2显示了如何设置SearchGUI和Peptide Shaker来从碎片数据中鉴定肽。
    
    小号视频2
使用HDExaminer计算氘摄入量
1. 通过测量给定肽的同位素分布质心的偏移来计算氘掺入。虽然这可以手动完成，但这非常耗时。有几个程序可以计算HDX数据的氘结合。 HDExaminer是由Sierra Analytics Inc.提供的商业可用程序，可以完成此项任务。
  注意：Sierra Analytics有几个教程视频来展示HDExaminer的功能以及如何设置该程序（ HDExaminer：The Basics ）。
2. 要设置HDExaminer，首先添加感兴趣蛋白质的序列，并在“蛋白质”页面上添加测试条件列表。这允许程序计算每种情况下的氘掺入量。
3. 接下来，在“肽”页面下添加肽列表，并选择具有每种肽的电荷，序列和保留时间的列。然后将肽添加到肽库。
4. 最后，在'分析'页面上添加每个条件的数据文件。所有条件都会有非氘化文件，首先添加。接下来添加完全氘化的数据文件（24小时时间点），然后添加部分氘化的数据文件（1分钟，3分钟，15分钟，1小时，3小时）。要自动开始计算，请选择屏幕右下角的“自动计算”框，否则将不得不手动开始计算。
  。右下角的进度条表示计算何时正在进行。
  注意：或者，可以从肽序列中可交换的酰胺氢的数量计算氘的最大数量。
5. 计算完成后，手动验证计算结果。
  1. 在HDExaminer的多肽标签下，每种肽都有一个显示不同条件的下拉菜单。每种条件都有一个额外的下拉菜单，显示基于肽库的肽的不同电荷状态。
  2. 如果HDExaminer成功识别数据文件中肽的位置，点击电荷状态将显示左侧每个数据文件中肽的同位素分布。右侧显示每个数据文件的色谱图，两个红色箭头显示含有肽同位素模式的保留时间窗口。
  3. 要验证数据，请检查肽的保留时间窗口，它们应该是相同的，或者每个数据文件在几秒钟之内。可以通过移动任一红色箭头来调整搜索窗口。如果部分氘化或完全氘化的数据文件发生变化，则仅重新计算这些文件的氘掺入量。但是，如果非氘化文件搜索保留时间发生变化，则重新计算该肽所有数据文件的氘掺入。
  4. 手动验证数据可确保为肽的所有数据文件使用相同的保留时间搜索窗口。这样可以最精确地测量氘的掺入量，并有助于最小化重复之间的误差。
6. 手动验证后，输出每种条件下的肽库结果，这提供了肽的鉴定，检索保留时间和收费。这也提供了开始和结束保留时间，掺入氘的量（#D），掺入氘的百分比（％D），每个时间点和重复的分数和置信度。
7. 肽库结果中提供的数据可以多种方式使用。
  1. 数据可视化的最简单方法是吸收曲线，显示随时间推移掺入肽中的#D。生成每个肽的曲线，以便比较每个测试条件随时间推移的氘掺入。图2B显示了一个吸收曲线的例子，显示了四种情况的比较。
  2. 另一种分析数据的方法是计算并入的％D并测量百分比差异以确定条件之间交换可访问性的相对变化。通过将#D从一个时间点除以完全氘代样品的#D来计算％D，然后乘以100.然后通过减去两个条件的％D来计算百分比差异。这样可以比较不同长度的肽之间的氘掺入。
  3. 将百分比差异映射到蛋白质结构（如果可用）以显示受不同条件影响的区域。将交换数据映射到结构上还可以揭示联合体的存在，以及蛋白质的哪些区域彼此通信以实现变构机制。
    注意：有关将交换数据映射到蛋白质结构的详细说明，请参阅数据分析。

数据分析

使用MassHunter定性分析在数据采集过程中通过检查氘代样品中同位素分布交换的证据来验证数据。这是通过比较氘化样品和非氘化样品来完成的。图2A通过显示非氘化，1分钟，15分钟和3小时时间点的同位素分布显示了一个例子。这允许比较同位素分布的变化，因为在测试条件之间掺入更多的氘。
计算氘掺入量后，使用Microsoft Excel或类似的电子表格程序生成吸收曲线，以比较肽内测试条件下氘掺入随时间的变化。图2B显示了一个示例摄取曲线。
为了比较多种肽和/或条件之间的氘掺入，将#D转换为％D并计算两种肽之间的差异。此外，使用UCSF嵌合体可以将差异百分比映射到蛋白质的3D结构上，如图3所示（Pettersen等人，2004年）。

图3. HDX-MS数据映射到蛋白质结构上。这种结构热图显示了NADPH和NAD +结合对Nfn交换的影响。在两种不同条件下收集的H / D交换数据使用UCSF嵌合体（参见注释）映射到蛋白质结构上。从纯化的交换和NADPH + NAD +结合的反应之间的差异计算热图。颜色代码被设置为红色（100％差异，增加交换），蓝色（-100％差异，保护）和灰色（0％差异，不变化）。在这个例子中，NADPH + NAD +结合条件比纯化的蛋白掺入更少的氘。
在UCSF Chimera中生成一个基于结构的HDX数据热图（Pettersen et al。，2004）。
1. 创建一个txt文件，以下列格式列出残留物编号和与残留物相关的％D：
  属性：nad_nadph-as_purified_nfn_3hrs_percent_deuterium
  匹配模式：1对1
  收件人：残留物＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;
  
  ：1.A 20
  ：2.A 20
  ：3.A 45
  ：4.A 45
  ：5.A 45
  
  标题命名将显示在模型上的属性，并定义残留是根据属性（而不是原子）进行着色的。 '：1.A'定义了残基编号和链名。选项卡将值与残余标识符分开。这些列可以在Excel或类似的电子表格程序中轻松生成，并保存为txt文件或复制/粘贴到文本文件中。如果没有残留物的数据，请在残留物识别符旁边留出空白处，或者彻底清除残留物。
2. 在Chimera中打开pdb蛋白质结构文件。转到工具＆gt;结构分析＆gt;定义属性。选择步骤a中生成的.txt文件。
  注意：如果列出了在结构文件中未解析的残基的数据，则会在弹出窗口中打开错误。这个错误可以忽略。
3. 一旦定义了属性，就会打开“按属性渲染/选择”窗口。使用此窗口可确定哪些颜色代表哪些％D值。
  1. 在txt文件中列出但没有与它们相关的数据的残留物将根据最高的％D颜色进行着色，除非在此值以上添加了其他颜色。
  2. 要添加其他颜色条，请使用Ctrl +在直方图中左键单击。 Ctrl +左键单击现有的颜色条以将其删除。
  3. 通过鼠标移动颜色条或在'数值'框中输入一个值。
4. 点击“应用”根据数据文件着色蛋白质结构。
5. 图3显示了一个彩色结构的例子。
注意：视频3显示了如何将HDX-MS数据映射到蛋白质的3D结构。

小号视频3

笔记

推荐的用于HPLC分离多肽的替代色谱柱与本文所述方案中使用的色谱柱相同，但内径要大1mm。这将影响通过色谱柱的溶剂流速，这可能会影响色谱柱中肽段的洗脱。强烈建议在进行交换反应之前测试不同的流速和梯度以优化肽的分离。
通过将校正因子（0.4个pH单位）加到测量的pH值，必须将测得的氘化缓冲液的pH校正为pD。对于该实验，在D 2 O中制备的三碱缓冲液具有7.0的测量pH，因此缓冲液的pD是7.4（Krezel和Bal，2004）。
在开始交换反应之前，检查含有甲酸，胃蛋白酶和反应缓冲液的骤冷溶液的pH为2.5，因此在蛋白质消化过程中不会发生回流交换。
将HPLC溶剂置于冰上，将柱温箱置于0°C，将自动进样器置于4°C以帮助减少氘代酰胺的回流交换。
HDX-MS可以在很宽的温度范围内进行。虽然汇率确实对温度有依赖性，但pH值可能会对它造成更多影响（Walters et al。，2012）。然而，应该注意的是，由于随着温度变化的汇率变化，在不同温度下运行的HDX-MS反应之间的比较分析是困难的。 HDX-MS通常在25°C（室温）下运行，但据报道有些情况下运行温度低至0°C，高达60°C。
在规划HDX-MS实验时，强烈建议感兴趣蛋白的起始浓度大约为10 mg / ml，这可以确保大约1.5μg蛋白被注入仪器。
1. 注入仪器的蛋白质量较低会导致肽在低强度下被检测到，这反过来可能会阻止准确计算氘的含量。
2. 鼓励将蛋白质1:10稀释到D 2 O缓冲液中，如果特定蛋白质不容易获得高浓度的等分试样，则可以做得更少。然后推荐进行一些中试实验以确保氘的掺入是令人满意的，并且反应中存在的额外的水不会引起氘离子的交换。

食谱

氧化氘中的Tris碱缓冲液（保质期〜一周）
100mM Tris-HCl
150 mM NaCl
用1N HCl调节pH至7.0
在H 2 O中的Tris碱缓冲液 100mM Tris-HCl
150 mM NaCl
用1N HCl调节pH至7.0
含有连二硫酸钠的Tris碱缓冲液 100mM Tris-HCl
150 mM NaCl
2 mM连二硫酸钠
用1N HCl调节pH至7.0

致谢

作为由美国能源部科学办公室（DE-SC0012518）资助的能源前沿研究中心生物和电子转移与催化（BETCy）EFRC的一部分，这项工作得到了支持。 MSU的质谱仪器部分由Murdock慈善信托基金和NIH IDEA计划资助P20GM103474资助。本协议中详述的工作改编自最近出版物（Lubner等人，2017; Berry等人，2018）中描述的工作。作者声明他们没有任何利益冲突。

参考

Berry，L.，Poudel，S.，Tokmina-Lukaszewska，M.，Colman，D.R.，Nguyen，D.M.N.，Schut，G.J.，Adams，M.W.，Peters，J.W.，Boyd，E.S和Bothner，B。（2018）。 H / D交换质谱和统计耦合分析揭示了铁蛋白依赖性分叉中的作用transhydrogenase catalytic cycle。
Demmer，J.K.，Rupprecht，F.A.，Eisinger，M.L.，Ermler，U.和Langer，J.D。（2016）。氢 - 氘交换显示的基于黄素的电子分叉酶复合物中的配体结合和构象动力学Mass Spectrometry。 FEBS Lett 590（24）：4472-4479。
Krezel，A.和Bal，W。（2004）。关联p K a 的公式在D 2 O和H 2 O中确定的值。Inorg Biochem 98：161- 166。
Lubner，CE，Jennings，DP，Mulder，DW，Schut，GJ，Zadvornyy，OA，Hoben，JP，Tokmina-Lukaszewska，M.，Berry，L.，Nguyen，DM，Lipscomb，GL，Bothner，B.，Jones ，AK，Miller，AF，King，PW，Adams，MWW和Peters，JW（2017）。通过基于黄素的电子分叉对机械能的保护 Nat Chem Bolsol 13（6）：655-659。
Pettersen，E.F。，Goddard，T.D.，Huang，C.C。，Couch，G.S。，Greenblatt，D.M.，Meng，E.C。和Ferrin，T.E。（2004）。 UCSF Chimera - 用于探索性研究和分析的可视化系统。 J Comput Chem 25（13）：1605-1612。
Walters，B. T.，Ricciuti，A.，Mayne，L.和Englander，S.W。（2012）。尽量减少氢气交换 - 质谱实验中的回流。 J Am Soc Mass Spectrom 23（12）：2132-2139。