材料和试剂

10μl移液枪头（Corning，目录号：4110或Denville Scientific，目录号：P1096）
200μl移液枪头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-705Y，或Denville Scientific，目录号：P1122）
1,000μl移液枪头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-706B，或Denville Scientific，目录号：P2103-N）
100毫米细胞培养皿（AS ONE，Violamo，目录号：2-8590-03或Corning，目录号：430167）
1.5ml微量离心管（Sorenson BioScience，目录号：11510或National Scientific，目录号：CN1700-BP）
预清洁无菌12-13毫米微玻璃盖玻片（Matsunami Glass，产品目录号：C013001或Thermo Fisher Scientific，产品目录号：12CIR-1.5）
35mm细胞培养皿（Corning，Falcon，产品目录号：353001或Corning，目录号：430165）
15 ml离心管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1332-015S或Corning，目录号：430053）
24孔板（Nunc TM，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：142475或Corning，目录号：3527）
Parafilm
14 x 16厘米玻璃（或塑料）板
微载玻片（Matsunami Glass，产品目录号：S024410）
0.22微米过滤器（Corning，目录号：431097或Advantec MFS，目录号：25CS020AS）
RPE-1细胞（ATCC，目录号：CRL-4000）
Midi制备的或Maxi制备的质粒（优选>1μg/μl）
注意：我们通常将cDNA（在CAG或CMV启动子下）或短发夹RNA（shRNA;在U6启动子下）插入同样表达GFP的质粒中（例如，pCAGIG载体）。
0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA（和光纯药工业，目录号：202-16931）
胎牛血清（FBS）（PAA Laboratories，目录号：A15-701）
Dulbecco改良Eagle培养基/ Ham's F-12（DMEM / F12）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：048-29785）
甲醇
单克隆抗乙酰化α-微管蛋白（Ac-Tub）抗体，克隆6-11B-1（Sigma-Aldrich，目录号：T6793）
抗微管蛋白抗体，Detyrosinated（默克，目录号：AB3201）
单克隆抗γ-微管蛋白抗体，克隆GTU-88（Sigma-Aldrich，目录号：T5326）
多克隆抗GFP标签抗体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-6455）
山羊抗小鼠IgG（H + L）抗体Alexa Fluor 568（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM目录号：A-11004）
山羊抗小鼠IgG 2b抗体，Alexa Fluor 568（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-21144）。
山羊抗小鼠IgG1抗体，Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A-21240）。
山羊抗兔IgG（H + L）抗体Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：R37116）
荧光固定介质（Agilent Technologies，Dako，目录号：S302380-2，代码号：S3023）或ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P36930）
指甲油
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（NACALAI TESQUE，目录号：08458-16）
100mM丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360070）
10×D-PBS（ - ）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：048-29805）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-00435）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：135-00165）
16％多聚甲醛（PFA）水溶液（电子显微镜科学，目录号：15710）
氯化铵（NH 4 Cl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-02995）
牛血清白蛋白（BSA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：010-15114）
Triton X-100（GE Healthcare，目录号：17-1315-01）
叠氮化钠（NaN 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：190-01272）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D1306）
生长培养基（见食谱）
用于细胞培养的PBS（见食谱）
2x PBSc / m（见食谱）
PBSc / m（见食谱）
4％PFA / PBSc / m（见食谱）
50mM NH 4 Cl（参见食谱）
BTPAD（见食谱）

设备

5％CO 2/95％空气组织培养箱（SANYO，型号：MCO-18AIC）
水浴（TOKYO RIKAKIKAI，Eyela，型号：NTT-1200）
血细胞计数器室（Erma，目录号：03-303-1）
低速离心机（TOMY SEIKO，型号：LC-100; Eppendorf，型号：5702）
移液器20μl（Pipetman P）（Gilson，目录号：F123600）
移液器200μl（Pipetman P）（Gilson，目录号：F123601）
移液器1,000μl（Pipetman P）（Gilson，目录号：F123602）
对于程序B1：
Neon TM转染系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：MPK5000）。
对于程序B2：
1. Nucleofector TM装置（Lonza，型号：Nucleofector TM TM）
2. 比色皿Plus TM电穿孔比色皿＆amp;转移提示（BTX，目录号：45-0135）
3. Amaxa®细胞系Nucleofector®Kit V（Lonza，目录号：VCA-1003）
镊子（精密科学工具，杜蒙，型号：＃5/45）
高压灭菌器（TOMY SEIKO，型号：LBS-245）
配备物镜（EC Plan-Neofluar 40x / 0.75，Carl Zeiss，产品目录号：440350-9903-000）的Epifluorescent显微镜（Carl Zeiss，型号：Axioplan 2成像）
共焦显微镜（ZEISS，型号：LSM-780）

程序

本分析按照以下时间表和程序进行（图1）。在本实验方案中，我们展示了每次转染的4个样品的制备（例如，在组装之前，0小时，2小时和24小时 - 在血清重新添加之后）。每个研究人员可以根据需要准备样品。例如，当我们专注于睫状体拆卸机制时，我们通常为每次转染准备三个样品（在血清重新添加后0 h-，2 h和24 h）。可以添加额外的样本来测试转染效率（第3天）。
第1天：细胞传代培养（见程序A）
第2天：细胞转染（参见程序B）;诱导睫状体组装（见程序C）
第3天：检查细胞转染效率
第4天：诱导睫状体分解（见程序D）;早期时间点（例如，0小时，2小时）细胞收获（见程序E）
第5天：晚点（例如，24小时）细胞收获
免疫染色（见程序F）和数据分析

图1.转染和睫状体组装/拆卸测定的时间线示意图

细胞亚文化（第1天）
在含有10％FBS的生长培养基中保持的RPE-1细胞（参见配方）在37℃的5％CO 2湿润培养箱中传代并使用标准技术铺板在100mm细胞培养皿上。第二天将细胞以预期50-80％融合的密度铺板。通常，当使用步骤B1（3×10 5个细胞）时，一个100mm培养皿的细胞（总共2-4×10 6个细胞）足以进行4-6次转染反应，用于每个反应的细胞）和2-4个转染反应，当使用程序B2时（每个反应1×10 6个细胞）。
注意：我们避免使用旧的（> 15次传代）或过度生长的RPE-1细胞，这往往具有较差的纤毛诱导率。
细胞转染（第2天）
Neon TM（程序B1）和Nucleofector TM（程序B2）转染系统产生相似的转染效率和低细胞死亡。转染后第二天，超过60％的GFP质粒转染的RPE-1细胞表达绿色荧光。相反，Lipofectamine 2000或聚乙烯亚胺（PEI）不会产生大量表达GFP的细胞。
在之前准备以下进行程序B1或B2中描述的转染程序。
1. 在37℃的水浴中预热生长培养基。将一个质粒（或预先混合的多个质粒，如果适用的话）放入一个无菌的1.5ml试管中。对于程序B1和B2的转染反应，分别使用〜3μg和〜6μg的DNA。
  如果执行程序B2，准备Amaxa转染主混合物。对于每个转染反应，通过轻轻移液和快速旋转将85.9μl溶液I和19.1μl溶液II混合。准备多余的反应来解决移液错误。
2. 在每个35毫米的细胞培养皿中放置三个或更多的酸洗过的无菌盖玻片。加入1毫升的生长培养基，并转移到37℃的5％CO 2培养箱中。
3. 对于每个转染反应，在1.5 ml无菌试管中准备1 ml预热生长培养基，并置于37°C水浴中。
4. 使用胰蛋白酶-EDTA溶液分离RPE-1细胞（每100毫米板0.5毫升）。在37℃孵育〜2分钟后，将分离的细胞收集到含有9.5ml温热生长培养基的15ml离心管中，其中FBS使胰蛋白酶失活。
5. 用血细胞计数器计数细胞的数量。
的 B1。霓虹 TM 转染系统
1. 在室温下将细胞悬浮液在280×g（1,200rpm）离心2分钟。
2. 吸出上清液。
  在10毫升无菌PBS中重悬细胞沉淀（参见食谱）。
3. 在室温下将细胞悬浮液在280×g（1,200rpm）离心2分钟。
4. 小心地吸出所有的上清液。用100μlResuspension Buffer R（包含在Neon TM转染系统中）每1×10 6个细胞重悬一次。每次转染需要30微升细胞悬液（即，3×10 5个细胞）。
5. 轻轻混合3微克质粒在30微升细胞悬液中
6. 使用10μlNeon TM尖端获得10μl细胞-DNA混合物，然后根据制造商的协议使用以下参数施加电脉冲（脉冲电压'1,050 V'，脉冲宽度'35毫秒“，脉冲数”2次“）。重复操作，直到细胞-DNA混合物的整个体积（30μl）被“脉冲”。
7. 紧接着每个脉冲之后，将转染的细胞转移到含有1ml温热生长培养基的1.5ml管中。使用相同的管收集所有3×10 5个转染的细胞。
8. 将转染的细胞铺在含盖玻片的35mm培养皿上并立即转移到37℃的5％CO 2培养箱12小时。
的 B2。 Nucleofector TM 转染系统
1. 对于每个转染反应，将相当于1×10 6胰蛋白酶-EDTA分离的RPE-1细胞的一定体积的细胞悬液转移到15ml管中。
2. 在室温下将细胞悬浮液在280×g（1,200rpm）下离心2-3分钟。
3. 小心地吸出所有的上清液。
  使用P200移液器，用100μlAmaxa转染母液轻轻悬浮细胞沉淀。
  注意：通过将400μl的4×10 6细胞与4×10 6细胞混合，可以在同一批次中进行多达4次转染反应。 Amaxa转染主混合物。
4. 对于每个转染反应，将100μl细胞悬液转移到含有DNA的1.5ml管中。轻轻吸移不超过两次，避免气泡。
5. 将整个细胞-DNA混合物转移到电穿孔比色杯（BTX）中。
  不要吸走最后一滴以避免气泡。
6. 将比色杯放入Nucleofector TM 设备中，用程序'T23'对单元进行脉冲。这是在设备中预设的程序，可以通过按下一个简单的按钮来选择。
7. 在脉冲之后立即使用精细吸头滴管（包含在独立包装的电穿孔比色杯中）将转染的细胞收集在比色杯中。将它们转移到含有1ml温热生长培养基的1.5ml试管中。
8. 将转染的细胞铺板在含有盖玻片和生长培养基的35mm培养皿上，立即将细胞转移到37℃的5％CO 2培养箱中12小时。
诱导睫状体组装（第2天）
1. 细胞转染后大约8-12小时（程序B），细胞应该沉降在底部。在研究人员希望在血清饥饿之前收集细胞样品（例如，在血清饥饿前观察纤毛或通过免疫染色测试转染效率）后，按照程序E进行。取出培养基，轻轻冲洗2毫升PBS中的细胞（三次），并加入2毫升预热的无血清DMEM（或DMEM / F12）。在此步骤中，我们没有注意到DMEM和DMEM / F12之间在装配或随后拆卸纤毛方面存在明显差异。
2. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育36-48小时。可选：在此期间（第3天），我们使用倒置相位/荧光显微镜检查绿色荧光阳性细胞以估计转染效率。
  通过观察从盖玻片/盘子上分离的细胞数量，我们也注意细胞毒性
诱导睫状体分解（第4天）
1. 在血清饥饿结束时，使用一对无菌镊子，取出一片盖玻片并立即清洗并固定它们（0 h时间点;参见程序E）。吸出无血清培养基并用生长培养基代替。
2. 将细胞在37℃的5％CO 2培养箱中培养指定的时间; 2小时和24小时将是很好的起点。
细胞收获（第2,4和5天）
1. 将一个或多个盖玻片从孵育后的35 mm培养皿转移到一个空的24孔培养板中，使用一对无菌镊子，细胞侧朝上。
2. 用1ml PBSc / m冲洗盖玻片3次（见食谱），并在室温下固定0.5ml 4％PFA / PBSc / m（见食谱）10分钟。
3. 用1ml PBSc / m冲洗盖玻片一次，并填充1ml另一种PBSc / m。
免疫染色
可以通过免疫染色乙酰化α-微管蛋白（Ac-Tub）或去酪氨酸微管蛋白来显示初级纤毛（图2）。可以通过γ-微管蛋白（γ-Tub）免疫染色检测基底体（图2B）。 γ-Tub染色方便地显示了纤毛的近端。这也是一个很好的里程碑，特别是在短或无法检测到纤毛的细胞中。然而，为了获得γ-Tub染色的信号，细胞必须用冷甲醇处理（参见步骤F2）。
每个研究人员可以根据自己的偏好进行免疫染色程序，诸如先前描述的程序（Phua et al。，2017; Shnitsar et al。，2015; Tomoshige et al。，2017）。下面，我们描述我们的Ac-Tub，γ-Tub和GFP的三重染色程序。 GFP染色用于增强对表达GFP（或GFP-融合蛋白）的转染细胞的检测。因此，目标分子在睫状体装配/分解中的作用可以在GFP阳性转染的细胞中明确地确定。
下面详述的整个过程在室温下在遮光湿度室（自制）中进行。
1. 在一个14 x 16厘米的玻璃（或塑料）板上放置一块石蜡膜。
2. 在-20°C预处理预先固定的盖玻片预冷甲醇1-3分钟。
3. 立即用PBSc / m冲洗细胞两次。
4. 将盖玻片放在封口膜上，使细胞面朝上。
5. 使用P1000移液管（或滴管）从盖玻片边缘加入〜300μl50mM NH 4 Cl（参见食谱）并孵育10分钟。
6. 从盖玻片边缘吸出NH 4 4 Cl，并用300μlPBSc / m冲洗一次。
7. 孵育100μlBTPAD（参见食谱）30分钟。
8. 在室温下孵育50-100μl含有一抗的BTPAD 60分钟。抗体稀释液：抗Ac-Tub（小鼠IgG 2b：1：1,000），抗γ-Tub（小鼠IgG 1：1：1,000），抗GFP （兔IgG，1：1,000）。
9. 通过将细胞以300μlPBSc / m孵育5分钟，除去未结合的一级抗体三次。
10. 在室温下孵育50-100μl含二次抗体的BTPAD 45分钟。抗体稀释：Alexa Fluor 568偶联的山羊抗小鼠IgG 2b（对于抗Ac-Tub，1：400），Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG 1 （对于抗γ-Tub，1：400）和Alexa Fluor 488缀合的山羊抗兔IgG（对于抗GFP，1：400）。
  注意：当细胞标记为Ac-Tub而不是γ-Tub时，在步骤F8中，同种型特异性二抗不是必需的。我们使用Alexa Fluor 568偶联的抗小鼠IgG（H + L）抗体。
11. 用300μlPBSc / m冲洗5分钟，三次。
12. 去除多余的PBSc / m，擦去盖玻片一侧的细胞。
13. 在盖玻片上安装4μl安装介质
14. 用清澈的指甲油密封盖玻片边缘
15. 在落射荧光显微镜（ZEISS，Axioplan 2成像）或共焦显微镜（ZEISS，型号：LSM-780）下观察样品。对于落射荧光显微镜，物镜：放大40倍而不浸泡。目镜：放大10倍。对于共聚焦显微镜，物镜：放大63倍，油浸。图2显示了在共聚焦显微镜上拍摄的代表性图像。
  
  图2.初级纤毛分别通过耗尽和重新添加血清进行装配和分解。在RPE-1细胞中组装的原代纤毛的代表性图像。为了呈现目的，使用共焦显微镜（ZEISS，LSM-780）获取图像。在血清饥饿（装配前），血清饥饿36小时后（0小时）和随后的血清再加入2小时和24小时收集细胞并标记为Ac-Tub（红色; A，B ），GFP（绿色; A）和γ-Tub（青色; B）。核用DAPI（蓝色; A）染色。虚线划分了单元格边界。（A）中的星号突出显示GFP + 细胞。（A）中的箭头指向GFP + 细胞中的纤毛。比例尺= 10微米（A）和2微米（B）。

数据分析

因为纤毛的长度与呈现纤毛的细胞的数量正相关，并且因为测量纤毛长度是劳动密集型的，所以显示出可检测纤毛的细胞的数量被计数为替代指标（Li等人，，2011）。
注：对于早期阶段的研究人员，我们建议用高倍镜片观察纤毛（例如63x，100x）。然而，我们必须注意到，研究人员需要调整Z位置以找到由于更高放大倍数而感兴趣的细胞之间的每个纤毛。

以双盲方式计数在GFP + - 转染的细胞中表达Ac-Tub的细胞的数量。在每个实验中计数超过100个细胞（两组50个细胞;一个来自每个盖玻片的左侧和另一个从右侧）。每个条件至少进行三次独立实验。来自独立实验的数据以平均百分比±SEM表示。单因素方差分析（ANOVA）或双因素方差分析（Two-way ANOVA）分别接受Tukey检验或Bonferroni检验（作为事后检验）（图3）。
图3A显示天然RPE-1细胞清除血清后睫状体组件的时间依赖性。
80％的细胞在血清饥饿后36小时表达纤毛。
图3B显示了睫状体分解测定的代表性结果。还显示了通过敲除Tctex-1的睫状体分解的实例。 Tctex-1是细胞质动力蛋白复合物的轻链，并且是用于睫状体分解的不可缺少的分子（Li等人，2011; Yeh等人，2013; Saito等人，等。，2017）。将Tctex-1的U6启动子和短发夹RNA（shRNA）序列插入也编码GFP的pCAGIG载体（参见材料和试剂＃13）（Li等人，2011）。用载体（对照）或Tctex-1-shRNA（Tctex-1-sh）转染的细胞血清饥饿36小时并用生长培养基退回2小时和24小时。在GFP + - 转染的细胞中计数具有纤毛的细胞数量。在对照装置的细胞中重新加入血清后，具有纤毛的细胞的百分比从80％（0h）降至60％（2h）和40％（24h）。尽管在Tctex-1-shRNA转染的细胞中睫状体装配未受影响，但这些细胞中的睫状体分解速率明显受到抑制。

图3.睫状体装配和分解测定的代表性结果。：一种。睫状体装配测定。在血清饥饿后的指定时间点收获幼稚RPE-1细胞。 Y轴显示表达纤毛的细胞的百分比。 B.睫状体分解测定。首先使用也表达GFP的对照载体或Tctex-1-shRNA转染的RPE-1细胞饥饿，然后用生长培养基处理指定的时间段。 Y轴显示了具有纤毛的GFP + / +细胞的百分比。 ## P ＆lt; 0.01， ### P ＆lt; 0.001;单因素方差分析，然后进行Tukey检验（与每组0小时时间点比较）。 ** P ＆lt; 0.01，*** P 0.001;双因素方差分析后接Bonferroni检验（组间比较）。每个实验n = 100个细胞，三个（A）和五个（B）独立实验。

食谱

生长培养基
1. 取500毫升的DMEM / F12
2. 加入50毫升FBS（最后10％）
3. 加入5.5毫升100mM丙酮酸盐（最终1mM）
4. 在4°C储存
用于细胞培养的PBS
1. 取180ml ddH 2 O
2. 加入20毫升10×D-PBS（ - ）
3. 高压灭菌器
4. 在室温下储存
2x PBSc / m
1. 取795毫升ddH 2 O
2. 加入200毫升的10倍D-PBS（ - ）
3. 加入400μl1M CaCl 2（最终0.4mM）
4. 加入4,000μl1M MgCl 2（最终4mM）
5. 通过0.22μm过滤器过滤
6. 在室温下储存
PBSC /米
1. 取500毫升ddH 2 O
2. 添加500毫升2x PBSc / m
3. 通过0.22μm过滤器过滤
4. 在室温下储存
4％PFA / PBSc / m
在化学罩内的操作之前准备
1. 取1ml ddH 2 O
2. 加2 ml 2x PBSc / m
3. 加1毫升16％PFA
50mM NH 4 Cl
1. 取20毫升ddH 2 O
2. 添加25毫升2x PBSc / m
3. 加入133.75mg NH 4 Cl（最终50mM）
4. 用ddH 2 O稀释至多50ml
5. 在室温下储存
BTPAD
1. 取25毫升的PBSc / m
2. 加625μl20％BSA（最后0.5％）
3. 加313μl20％Triton X-100（最后0.25％）
4. 加入250μl2％NaN3（最终0.02％）
5. 加入2.5μl3mM DAPI（最终0.3μM）
6. 通过0.22μm过滤器过滤
7. 在4°C储存

致谢

该协议是从以前发表的研究（Saito等人，2017年）改编的。这项工作得到了NIH RO1 EY11307，EY016805，防盲研究，创新奖获奖者（RPB）和高雄医科大学研究基金会（105KMUOR02）（对C.-H. S.）的支持。日本科学促进会科学研究资助计划（编号23770136，编号15K20856，M.S.）和武田科学基金会（编号M.S.）。我们要感谢生物医学研究核心（东北大学医学研究生院）。我们还要感谢Editage（ www.editage.jp/ ）进行英文编辑。作者声明没有竞争的财务利益。

参考

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Phua，S.C.，Chiba，S.，Suzuki，M.，Su，E.，Roberson，E.C.，Pusapati，G.V.，Setou，M.，Rohatgi，R.，Reiter，J.F.，Ikegami，K.，et al。（2017年）。
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Saito，M.，Otsu，W.，Hsu，K. S.，Chuang，J.Z.，Yanagisawa，T.，Shieh，V.，Kaitsuka，T.，Wei，F.Y.，Tomizawa，K。和Sung，C.H。（2017）。 Tctex-1通过调节分支肌动蛋白聚合和内吞作用来控制睫状吸收 EMBO Rep 18（8）：1460-1472。
Shnitsar，I.，Bashkurov，M.，Masson，GR，Ogunjimi，AA，Mosessian，S.，Cabeza，EA，Hirsch，CL，Trcka，D.，Gish，G.，Jiao，J.，Wu，H. ，Winklbauer，R.，Williams，RL，Pelletier，L.，Wrana，JL和Barrios-Rodiles，M.（2015）。 PTEN通过Dishevelled来控制纤毛 Nat Commun 6： 8388。
Tomoshige，S.，Kobayashi，Y.，Hosoba，K.，Hamamoto，A.，Miyamoto，T.和Saito，Y。（2017）。黑色素浓集激素受体1介导的原发性纤毛缩短的细胞骨架相关调节。 Gen Comp Endocrinol 253（1）：44-52
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