材料和试剂

1.5ml微量离心管（Corning，Axygen？，目录号：MCT-150-C）
锥形管，15ml（Corning，Falcon ，目录号：352096）
幻灯片（VWR，目录号：48300-025）
96孔微量培养板，黑色（SPL Life Sciences，目录号：30496）
60毫米培养皿（SPL Life Sciences，目录号：10060）
铂丝，0.2毫米（阿法埃莎，产品目录号：45093）
秀丽隐杆线虫野生型[N2]（ Caenorhabditis 明尼苏达大学遗传学中心： https://cgc.umn.edu ）
大肠杆菌OP50菌株（ Caenorhabditis Genetic Center）
蒸馏水
2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：D6883）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
甲基紫精二氯化物水合物（Merck，目录号：856177）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
细菌蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211677）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
磷酸氢钾，二元酸（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
磷酸钾，一元（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
次氯酸钠（NaClO）（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
5毫克/毫升胆固醇（见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
漂白液（见食谱）

设备

摇动培养箱（台式摇床培养箱，VWR，型号：1570型）
Micropipette（VWR国际）
稳定温度的培养箱（VWR SIGNATURE 20-cuft型号2020 B.O.D. -10°C至45°C低温培养箱）（VWR，Advanced Instruments，型号：2020型）
台式离心机（VWR，型号：VWR Mini离心机C1413V）
解剖立体显微镜（具有复消色差光学徕卡S8 APO的立体显微镜）（Leica Microsystems，型号：Leica S8 APO）
荧光光度计（Promega，型号：GloMax®-Multi Microplate Multimode Reader）
涡旋混合器（标准重型涡旋混合器，VWR，目录号：97043-562）
高压灭菌器（Hanshin Medical，型号：HS-2321SD）

软件

Microsoft Office 2017 Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）
IBM SPSS statistics 24（IBM Corporation，纽约，美国）

程序

在正常培养条件下测量线虫的细胞内ROS
1. 准备一个同步的线虫种群
  1. 用1ml M9缓冲液洗涤含有完全成虫和鸡蛋的平板。
  2. 将线虫悬液转移到微量离心管中。
  3. 以3,884 emg（rcf; 8,500rpm）旋转1分钟并除去上清液。
  4. 加入200μl蒸馏水（D.W.）和800μl漂白溶液。
  5. 等待超过90％的线虫溶解并释放几个胚胎[请参阅Bianchi和Driscoll（2006）第3.2节）。
    注意：3分钟后每30秒检查一次溶解。以最大速度涡旋约2-3秒，有助于漂白剂溶解。
  6. 以3,884 emg（rcf; 8,500rpm）旋转1分钟并除去上清液。
    注意：小心不要打扰颗粒。
  7. 用M9缓冲液（各1ml）洗涤三次：以137gxg（rcf; 1,000rpm）离心1分钟并除去上清液。
  8. 用1ml M9缓冲液将胚胎转移到含有1ml M9（总共2ml）的锥形管中。
  9. 在20°C孵育过夜，摇动30转，让L1幼虫孵化。
2. 计数动物和线虫解决方案的准备
  1. 重新悬浮幼虫沉淀，并将10微升悬浮液铺在载玻片上。这样做一式三份。
  2. 使用解剖立体显微镜计算线虫的数量，并计算每个液滴中L1幼虫的平均数量。
  3. 添加适量的M9缓冲液以稀释幼虫悬浮液。
  4. 轻轻摇动并重新计数。
  5. 重复步骤A2b-A2d，直到线虫数量达到每10μl约50个。
3. 制备H 2 DCFDA反应溶液
  1. 通过将24.365mg H 2 DCFDA溶解在1ml细胞培养级别的DMSO中来制备浓缩储液（50mM）。
  2. 分成100微升等分试样在黑色的离心管中，并储存在-20°C（稳定至少3个月）。
  3. 根据需要用M9缓冲液将原液稀释至50μM（需要的体积=测试孔的数量x 50μl）。
    注意：工作解决方案应在使用前尽快准备。
4. 使用荧光光度计测定细胞内ROS水平
  1. 打开荧光光度计并设置印版设置。
  2. 加入40μlM9缓冲液到黑色96孔板的孔中。
  3. 每孔加入10μl线虫溶液（步骤A2中制备）
  4. 加入50μlH 2 DCFDA反应溶液至终浓度为25μM。
  5. 通过加入50μl的M9和50μl的H 2 DCFDA反应溶液来制备空白孔。
  6. 立即将平板插入荧光光度计，轻轻摇动30秒。
  7. 在激发波长为490纳米和发射波长为510-570纳米时量化荧光强度
  8. 每小时测量荧光信号（最长6小时），并通过USB端口输出原始数据（见图2A）。
注意：所有步骤都应在RT完成。
在氧化应激条件下测量线虫的细胞内ROS
1. 百草枯诱导的氧化应激
  1. 在D.W.中溶解甲基紫精二氯化物水合物（百草枯）粉末制成50 mM百草枯溶液。
  2. 按步骤A1所述准备被捕的L1幼虫。
  3. 向9份含L1的M9缓冲液（1:10稀释）中加入1份50mM百草枯，并在摇动培养箱中以30rpm振荡在20℃孵育2小时。
  4. 用M9缓冲液（各1ml）洗涤三次：以137gxg（rcf; 1,000rpm）离心1分钟并除去上清液。
  5. 按照步骤A2所述准备线虫解决方案。
  6. 按照步骤A3和A4所述量化细胞内ROS水平。
2. 热诱导的氧化应激
  1. 按步骤A1和A2所述准备被捕的L1幼虫和线虫溶液。
  2. 在30°C孵育线虫2小时，在摇动培养箱中摇动30 rpm。
  3. 如步骤A3和A4中所述量化细胞内ROS水平。
    注意：在整个测量过程中，将荧光光度计的温度保持在30°C。

数据分析

对于每种情况，使用至少20只动物来获得准确的结果。
每个实验至少应执行三次独立时间。
将空白扣除的原始数据（DCF荧光水平）归一化为野生型（或未处理）线虫的数据，并且使用Microsoft Office 2017 Excel软件以平均值±标准差表示。
Tukey事后检验的单因素方差分析使用IBM SPSS统计数据24进行，以分析组间差异的统计显着性。

笔记

与许多其他荧光探针一样，H 2 DCFDA具有光敏性，因此处理时对光的最小曝光量至关重要。
当使用H 2 C DCFDA测量细胞内ROS时，应使用整体线虫代替裂解线虫。线虫。裂解导致外表皮和内膜的破坏，随后释放细胞内金属离子如铁。由于游离铁可以通过Fenton反应自身产生ROS，与线虫中的测量相比，裂解线虫中的ROS水平可能被高估。
由于H 2 DCFDA容易扩散到细胞中直到达到平衡，因此可以检测到增加的基础荧光信号的时间过程。在动物死亡的时间点，逐渐增加的趋势转变为急剧上升的趋势。因此，在开始实验后的4或6小时内进行测量是合适的。
成人线虫（年龄同步）也可用于测试化合物在氧化应激条件下的抗氧化能力，稍作修改。建议使用少量的线虫（10-20蠕虫/孔）。此外，增加百草枯浓度需要在成人线虫中诱导明显的氧化应激（超过20 mM，最终浓度）。但是，对于老化的线虫应该使用相对较低浓度的百草枯。

食谱

5毫克/毫升胆固醇
将5毫克胆固醇粉末溶于1毫升100％乙醇中，并在4℃下储存
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（每L）
3克的NaCl
2.5克蛋白胨
17克琼脂
1毫升胆固醇溶液（5毫克/毫升）
1毫升CaCl 2（1M）
1毫升MgSO 4（1M）
25毫升磷酸钾（1M，pH 6.0）

975毫升蒸馏水高压灭菌器并冷却至50°C
将10毫升NGM琼脂倒入60毫米培养皿中并让其硬化1小时
M9缓冲区
3克KH 2 PO 4 4/2 6克Na 2 HPO 4 4 5克的NaCl
1毫升MgSO 4（1M）
用蒸馏水补充1升
高压灭菌器
漂白解决方案
6.25毫升4M NaOH
2.5毫升的NaOCl
50毫升的M9缓冲液

使用前新鲜准备

致谢

这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF-2017R1C1B5015695）对DSC，Brody Brothers Endowment Grant（21602-664261），NIH（1R15GM112174-01A1），NSF（MCB1714264）向M-H.L的支持。 Caenorhabditis遗传中心（CGC）由美国国立卫生研究院 - 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）提供支持。该协议已由Yoon et al。改编，2017年。作者声明不存在相互竞争的利益。

参考

Bianchi，L.和Driscoll，M。（2006）。胚胎培养C。 elegans 用于电生理和药理学分析。 WormBook 1-15。
Labuschagne，C.F。和Brenkman，A.B.（2013）。当前在线虫体内定量ROS和氧化损伤的方法和其他模型衰老有机体衰老修复 12（4）：918-930。
Miranda-Vizuete，A.和Veal，E.A。（2017）。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为理解生理和疾病中ROS功能的模型。 Redox Biol 11：708-714。
Yoon，DS，Choi，Y.，Cha，DS，Zhang，P.，Choi，SM，Alfhili，MA，Polli，JR，Pendergrass，D.，Taki，FA，Kapalavavi，B.，Pan，X.，Zhang ，B.，Blackwell，TK，Lee，JW和Lee，MH（2017）。三氯生破坏SKN-1 / Nrf2介导的氧化应激反应。线虫和人类间充质干细胞。 Sci Rep 7（1）：12592。