材料和试剂

移液器吸头
注意：建议使用低保留提示。
1.5 ml微量离心管（Eppendorf，目录号：0030108051）
PCR管（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：A30588）。
清洁剃须刀片
Qubit dsDNA BR Assay Kit（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32850）（用于量化与Qubit荧光计结合的双链DNA）
（新英格兰生物实验室，目录号：R0525S）（用于消化玉米基因组DNA，包括CutSmart缓冲液）
注意：可以根据步骤A中的硅片选择结果替换酶。
琼脂糖
注意：对于凝胶大小选择，我们推荐低熔点琼脂糖。
TBE缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15581044）
AMPure XP（Beckman Coulter，目录号：A63881）
绝对乙醇
注意：要稀释，请使用不含DNase / RNase的蒸馏水。
1M Tris-HCl（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15568025）
注意：要稀释，请使用不含DNase / RNase的蒸馏水。
NEBuffer 2（New England Biolabs，目录号：B7002S）
Klenow片段（3'→5'exo-）（New England Biolabs，目录号：M0212S）（用于末端修复和A尾DNA）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S，包括T4 DNA连接缓冲液）（用于连接测序接头）
100-bp DNA梯子
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，产品目录号：28704,28706）
EpiTect快速亚硫酸氢盐转化试剂盒（QIAGEN，目录号：59824）
注意：根据制造商的指导，将该套件保持在适当的温度。
TruSeq DNA LT样品制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-2001）
PfuTurbo DNA聚合酶（Agilent Technologies，目录号：600250）
不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液组（New England Biolabs，目录号：N0446S）
MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
10 mM dNTP混合物（见食谱）
5倍RRBS dNTP混合（见食谱）

设备

移液器：
1. Thermo Scientific Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：P5000，目录号：4641110N
2. Thermo Scientific Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：P1000，目录号：4641100N
3. 赛默飞世尔科技有限公司 TM ，型号：P300，目录号：4641090N
4. Thermo Scientific Scientific，Thermo Scientific TM，型号：P200，目录号：4641080N
5. 赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM ，型号：P100，目录号：4641070N
6. 赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM ，型号：P20，目录号：4641060N
7. 赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM ，型号：P10，目录号：4641030N
8. Thermo Scientific Scientific，Thermo Scientific T M，型号：P2，目录号：4641010N
Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，型号：Qubit 2.0荧光计，目录号：Q32866）
加热块（Eppendorf，型号：ThermoMixer comfort，目录号：5355000011）
孵化器（仅科学，Firstek，型号：S300）
热循环仪
1. Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：GeneAmp TM PCR System 9700，目录号：4413750
2. Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM Thermal Cycler，产品目录号：1861096
离心分离机
1. Eppendorf，型号：Centrifuge MiniSpin ®，产品目录号：5453000011
2. Eppendorf，型号：离心机5424，目录号：5424000410
3. GYROZEN，型号：1730R
磁性支架
1. Thermo Fisher Scientific，DynaMag TM -2磁铁，目录号：12321D
2. Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，DynaMag TM -PCR Magnet，目录号：492025

软件

系统要求：Linux / Unix或Mac OS，Python 2.7+，R 3.2.0
Python和R脚本和教程可在以下网址找到： https://gitlab.com/fmhsu0114/maize_RRBS < br />

程序

完整的流水线包含1. in slico 酶选择，然后是2. RRBS文库制备。所产生的文库将被测序以在感兴趣的基因组区域产生DNA甲基化概况。

在计算机中选择酶
1. 克隆GitLab项目： https://gitlab.com/fmhsu0114/maize_RRBS 。
2. 下载您感兴趣的基因组FASTA文件，即，maize_genome.fa，然后使用以下命令构建基因组数据库：
  $ python Build_Gnome.py AGPv3.fa
  将生成2个输出文件（genome.shelve和log-genome.txt）。
3. 下载注释refFlat文件，即，refFlat.txt，然后使用以下命令构建基因注释数据库：
  $ python Build_refgene_shelve.py refFlat.txt log-genome.txt
  1输出文件（refgenes.shelve）将被生成。
4. 将注释gff3文件和grep'repeats'下载到单个文件中，即，repeats.gff3，然后使用以下命令构建重复注释数据库：
  $ python Build_repeats_Gnome.py repeats.gff3，log-genome.txt
  1个输出文件（repeat.shelve）将被生成。
5. 使用以下命令构建基因组CG，CHG和CHH站点数据库：
  $ python Build_CG_CHG_CHH_Gnome.py genome.shelve log-genome.txt
  1输出文件（CG_CHG_CHH.shelve）将被生成。
6. 使用以下命令在GitLab项目（enzyme_cutting_sites.txt）中提供的酶列表执行 in silico 消化：
  $ python Enzyme_digestione.py
  将生成每种酶的fragment_info（每个MSRE和每个大小范围）和一个Summary-enzyme-coverage.txt文件。
7. 将输出文件从1.6放到一个目录./fragment/中，并使用以下命令运行浓缩分析：
  $ python RRBS_fragments_enrichment.py repeats.shelve，refgenes.shelve
  将生成log（sub-2）_fold_enrichment（每个MSRE和每个大小范围）文件（见表1）。
  
  表1. Mse I 40-300-bp片段的log2浓度倍数富集值
8. 将所有log 2 _fold_enrichment文件移动到一个目录中./output/并使用以下命令绘制浓缩条形图：
  $ Rscript Barchart_enrichment.R
  
  见图2到图4
  
  图2. I 40-300-bp片段的条形图显示了启动子的富集
  
  图3. Cvi的条形图QI 40-280-bp片段显示富含外显子，内含子，UTR和剪接位点 >
  
  图4. BFA的条形图I 50-300-bp片段显示了启动子的富集
9. 使用以下命令来计算覆盖的启动子和基因体区域：
  $ python RRBS_fragments_enrichment_gene_level_per_MRE_Size.py -i Enzyme -s size_range -c 1
  这个脚本有3个参数：
  -i：限制酶
  -s：大小选择范围，例如，40-280
  -c：包含每个启动子/基因体的胞嘧啶的数量
  将生成输出文件Fragment-Enrichment-genebody-pmt-Enzyme-size_range-1.txt（表2和表3）。该文件包含缩减表示（RR）基因组中包含的启动子和基因体的百分比。
  注：在表2和表3中，Pct指的是百分比; Pmt是指启动子。
  
  表2. 40-300-bp片段中包含的启动子和基因体
  
  表3.在 Bfa I 50-300-bp片段中包含的启动子和基因体
RRBS图书馆准备
1. 根据制造商的说明，使用Qubit荧光定量法与Qubit dsDNA BR分析来定量玉米基因组DNA。
  注意：为了获得高质量的双链基因组DNA，我们推荐基于旋转柱的DNA提取试剂盒，例如QIAGEN DNeasy Plant Mini试剂盒。如果使用Pheno-Chloroform方法，我们建议再进行一次基于离心柱的纯化。
2. 将1微克玉米基因组DNA分装入1.5毫升试管中，加入5微升10x CutSmart缓冲液，1微升MseI I和ddH 2 O至终体积为50微升。
  使用移液管小心混合，并在37°C的加热块上孵育4小时。
  注意：这里使用的MseI是为玉米中启动子富集的RRBS设计的。对于不同的基因组（生物体），研究人员应该进行'硅片酶选择'并用预测的酶取代MseI，并根据制造商的说明修改消化时间，缓冲液和温度。
3. [可选]取5μl用于凝胶电泳（100 ng，1.5％，0.5x TBE），并向酶消化产物中加入5μlddH 2 O。
  注意：这一步是为了确认酶的消化效率。
4. 后消化AMPure珠子纯化
  1. 加入150μl反相AMPure XP珠溶液到50μlDNA中，涡旋10秒，短暂离心并在室温孵育5分钟。
    注意：当使用AMPure XP珠粒涡旋溶液时，避免高涡旋强度导致气泡。涡旋振荡后，使用微量离心机快速旋转以去除盖子和管壁上的液体。
  2. 将试管放在磁力架上3分钟。
  3. 去除上清液。
  4. 加入200μl的80％乙醇，不打扰珠子，并在室温孵育30秒。去除EtOH。
    注意：请勿将磁力管从磁力架上取下。
  5. 重复洗涤步骤B4d。
  6. 将珠子风干5分钟。
  7. 从磁力架上取下管子。
  8. 加入32μl10mM Tris-HCl并上下移液以充分混合。在室温孵育2分钟。
  9. 将试管放在磁力架上3分钟。
  10. 将上清液转移到PCR管中。
5. 结束修理和A-tailing
  1. 向纯化的DNA中加入6μl10x NEBuffer2,12μl5×RRBS dNTP混合物和3μl3'→5'Klenow外切酶并加入ddH 2 O至终体积60μl 。
  2. 使用热循环仪在30°C孵育20分钟和37°C孵育20分钟，然后将试管置于冰上。
6. 用AMPure XP珠子进行DNA纯化
  1. 将180μl反相良好的AMPure XP珠加入到60μlDNA中，涡旋10秒，短暂离心并在室温孵育5分钟。
  2. 将试管放在磁力架上3分钟。
  3. 去除上清液。
  4. 加入200μl的80％乙醇，不打扰珠子，并在室温孵育30秒。去除EtOH。
    注意：请勿将磁力管从磁力架上取下。
  5. 重复洗涤步骤B6d。
  6. 将珠子风干5分钟。
  7. 从磁力架上取下管子。
  8. 加入24μl的10 mM Tris-HCl并上下吸取混匀。在室温孵育2分钟。
  9. 将试管放在磁力架上3分钟。
  10. 将上清液转移到PCR管中。
7. 用TruSeq甲基化Illumina适配器进行连接
  1. 加入3微升10x T4 DNA连接缓冲液，2微升适配器和1微升T4 DNA连接酶到24微升末端修复和A尾巴的DNA，最终体积为30微升。
  2. 在16°C孵育过夜的热循环仪
8. 凝胶大小选择（图5）
  1. 将所有接头连接的DNA加载到1.5％0.5x TBE凝胶（每孔15μl，总共2个孔）中，用100-bp DNA梯进行凝胶电泳。
  2. 每个样品使用干净的剃须刀片切割40-300-bp片段，并使用QIAGEN Qiaquick凝胶提取试剂盒按照生产商的说明纯化DNA。用总体积为34μl的EB缓冲液洗脱DNA两次。将溶液转移到PCR管中。取1μl用于Qubit定量（可选）。
  注意：在选择凝胶尺寸时应避免紫外线。由于接头序列大约为120bp，因此我们从凝胶中切下了160-420bp的片段。对于上一步中的每个孔，请使用一个QIAGEN Qiaquick Gel Extraction反应。对于第一轮洗脱，向每个MinElute离心柱中加入10μlEB缓冲液，并将20μl溶液收集到一个新管中。然后使用另外14微升EB缓冲液逐一洗脱每个离心柱中剩余的DNA。
  
  图5.凝胶大小选择
9. 亚硫酸氢盐转化
  注意：确认EpiTect Fast Bisulfite转换工具包中的试剂已准备好使用。
  1. 向DNA溶液中加入不含RNase的水至终体积为40μl，用移液管混匀并将20μl等分至另一个PCR管中。
  2. 加入35μl的DNA保护缓冲液和85μl的亚硫酸氢盐溶液到每个管中，最终体积为140μl，并用轻柔移液彻底混合。
  3. 使用以下程序在热循环仪中运行：
    
    然后保持在20°C。盖温度：100°C。
10. 用微量离心机轻轻离心含有亚硫酸氢盐反应的PCR管，以从管盖中取出液体并转移到清洁的1.5ml微量离心管中。对于每个试管，加入310μl含有10μg/ ml载体RNA的新鲜制备的缓冲液BL，用移液器充分混合，然后短暂离心。
11. 加入250μl的96-100％乙醇，轻轻吸取10秒，然后短暂离心。
12. 将所有的解决方案都转移到带有收集管的MinElute DNA离心柱上。以最大速度离心1分钟并丢弃流通液。
13. 洗涤
  向每个离心柱加入500μl缓冲液BW，以最大速度离心1分钟并丢弃流出液。
14. 脱磺化
  1. 向每个离心柱加入500μl缓冲液BD，并在室温孵育15分钟。
  2. 最大速度离心1分钟并丢弃流通液。
  3. 向每个离心柱加入500μl缓冲液BW，以最大速度离心1分钟并丢弃流出液。
  4. 重复洗涤步骤B14c。
  5. 向每个离心柱中加入250μl96-100％EtOH，并以最大速度离心1分钟。
  6. 将每个离心柱放入干净的1.5 ml微量离心管中，打开盖子并使用60°C加热块进行孵育以蒸发液体。
  7. 通过向离心柱膜的中心添加15μl缓冲液EB来洗脱DNA，盖上盖子并在室温孵育1分钟。
  8. 在15,000×g g离心1分钟。
15. PCR扩增
  1. 向洗脱的DNA溶液中加入2.5μlIllumina TruSeq PCR引物混合物，0.5μl10mM dNTP，5μl10x Pfu Turbo缓冲液，0.5μlPfu Turbo DNA聚合酶和26.5μlddH 2 O到50μl的最终体积。彻底混匀并短暂离心。
  2. 使用以下程序在热循环仪中运行：
16. 用AMPure XP珠子进行DNA纯化
  1. 将150μl反相良好的AMPure XP珠加入到50μlDNA中，涡旋10秒，短暂离心并在室温孵育5分钟。
  2. 将试管放在磁力架上3分钟。
  3. 去除上清液。
  4. 加入200μl的80％乙醇，不打扰珠子，并在室温孵育30秒。去除EtOH。
    注意：请勿将磁力管从磁力架上取下。
  5. 重复洗涤步骤B16d。
  6. 将珠子风干5分钟。
  7. 从磁力架上取下管子。
  8. 加入22μl10mM Tris-HCl并上下移液以充分混合。在室温孵育2分钟。
  9. 将试管放在磁力架上3分钟。
  10. 将上清转移至1.5 ml微量离心管中。
17. 用Qubit分析量化最终的文库浓度。
18. 用Illumina双端测序法对RRBS文库进行测序。任何常规的双末端阅读长度，例如，100-250 bp，都可以。

数据分析

我们的电子管管道为每种酶及其相关的大小选择范围创建一张表格和条形图。图1是该流水线的流程图，用户可以看到每个步骤的输入和输出文件。图2是条形图，显示从大约40-300bp大小的选择的MseI消化的DNA中富集每个潜在的ROI。 X轴在log 2 范围内，所以值＆gt; 0可被认为是这些Mse I消化的DNA片段的富集物。表1包括用于绘制图2的值。从图2和表1，我们可以看出，MseI消化的40-300bp片段富集于启动子中。作为替代方案，图3显示了另一种酶（CviQI）40-280bp的结果，其中片段在外显子，剪接位点，内含子和UTRs中更富集。
不同的酶产生相似的富集值。图2和图4表明在启动子中富含Mse I 40-300-bp和Bfa I 50-300-bp片段。表2和表3显示了所涵盖的启动子和基因体百分比的统计。对于MseI RR基因组，通过测序566Mbp的2.1Gb基因组，包括84.3％的启动子。至于BfaI RR基因组，测序23.0％的基因组包括74.8％的启动子。用户需要确定基因组4.4％和8.5％启动子的成本之间的权衡。

的结论

我们提供了一个计算机管道管道执行投资回报指导的RRBS在玉米与实验可验证的预测。用户运行我们管道的最关键步骤是：1）准备输入文件; 2）选择一种最佳的酶来显示所选ROI的清晰富集（见图2）。
输入文件通常可以从公共数据库下载，例如Ensembl（Zerbino et al。，2017）。需要注意的是，我们的管道需要一个单独的.gff3格式的重复注释文件。除了条形图和表格（图2和表3）外，当判断哪个大小选择区域是最佳的时候，还应该考虑测序平台的总RR基因组大小和阅读长度。例如，如果两个RR基因组在启动子中显示2个富集，一个覆盖整个基因组的50％，而另一个涵盖25％，则应该考虑测序成本和信息数量之间的折衷。
对于实验验证，尺寸选择和亚硫酸氢盐转化是最关键的步骤。在此协议中，我们使用凝胶大小选择来确保片段长度可以被可视化。作为替代方案，也可以使用AMPure XP珠子。为了确保有效的亚硫酸氢盐转化，可以在酶消化之前将0.01％剪切的λ噬菌体DNA汇集到原始基因组DNA中。由于λ噬菌体DNA缺乏甲基化胞嘧啶，通过计算λ噬菌体DNA的甲基化水平来评估亚硫酸氢盐转化效率可以估算出非转化率。

食谱

10 mM dNTP混合物
10 mM dATP
10 mM dTTP
10 mM dCTP
10 mM dGTP
5x RRBS dNTP混合
200μMdATP
200μMdTTP

致谢

本研究得到中科院植物与微生物生物学研究所的资助和台湾科学技术部的资助（106-2633-B-001-001）至P.-Y.C.我们感谢Yi-Jing Lee提供设备信息。作者声明他们没有竞争性的经济利益。

参考

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