材料和试剂

蔗糖
HEPES
EDTA
DTT
L-半胱氨酸
MgCl 2
PVP
Complete，Mini，无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04693159001）
BSA
Bio-Rad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Tris-HCl
将3,3' - （ - [（苯基氨基）羰基] -3,4-四唑鎓） - 双（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸水合物（XTT）（Sigma-Aldrich，目录号：X4626）
NADPH（Sigma-Aldrich，目录号：N1630）
蛋白质提取工作溶液（参见配方）

设备

微量滴定板读数器（Infinite M200 Pro，Tecan）
微量离心机（AqquSpin Micro R）（Thermo Fisher Scientific）
超速离心机（Optima TLX，Beckman）
微量滴定板（BD Biosciences，目录号：353075）

程序

蛋白质提取和膜组分与植物组织的分离
1. 收获组织在液氮。如果不立即使用，保持在-80℃直到处理
2. 在液氮中研磨组织，并在已经在液氮中预冷并用于去皮的空Falcon管中称出0.5g的研磨组织。
3. 加入6ml冰冷的蛋白质提取缓冲液在冰上研磨组织
4. Vortex室温下彻底混合
5. 通过四层奶酪布过滤均质组织，并在冰上将滤液（流通）转移到2ml微量离心管中。
6. 在4℃下以10,000×g离心45分钟，并将上清液转移到超离心管中。
7. 通过在4℃下以203,000×g超速离心60分钟分离总膜级分。
8. 弃去上清液并在1ml冰冷的10mM Tris-HCl（pH7.4）中重悬沉淀
使用Bradford微量测定法（160μl）
1. 制备从5μg至25μg/ml范围内的BSA标准品，如下所示：
  
  这些标准将用于生成标准曲线。
2. 使用96孔微量滴定板制备反应混合物
3. 准备空白，一次加入160μl水到一个孔，一式三份
4. 通过加入2μl上清液（从第1部分）到158μl水制备测试样品
5. 向BSA标准品，空白和测试样品中加入40μlBradford测定试剂
6. 混合并在室温下孵育5分钟，并在平板读数器分光光度计上读取在595nm处的吸光度（A <595）。
  如果分光光度计不包括用于生成标准曲线以自动估计蛋白质含量的软件，可通过绘制已知蛋白质浓度）与吸光度（在Y轴）。通过绘制未知物的吸光度（在y轴上）作图并确定交叉点来估计给定未知样品的蛋白质浓度点与BSA标准曲线，然后找到与该特定点（在x轴）相关的浓度。如果使用excel，在绘制浓度与A 之后，获得趋势线并使用线的方程， sub> 595 来解析未知浓度。
NADPH氧化酶活性测定
1. 制备1mM XTT和1mM NADPH的新鲜溶液
2. 准备两种不同的测定溶液A和B：
  
  因为膜部分可以自发地减少XTT，即使没有底物（NADPH），有必要制备两个空白，更正此背景活动级别。
3. 准备空白：
  空白1：向240μl测定溶液A中加入10μl水空白2：向240μl测定溶液B中加入10μl膜级分
4. 通过加入10μl膜部分（从部分1）到240μl测定溶液A制备样品。在0分钟时读取492nm处的吸光度（A 492），然后以20分钟的间隔读取1小时或直到达到饱和点
5. 为了获得最终的A 492 空白读数，减去A ₄₉₂ Blank1和A <49>
6. 通过使用消光系数2.16×10 4 cm -1计算O 2生成率（Jiang和Zhang 2002）。< br /> （ΔA 492nm/min测试/ΔA 492nm/min空白）/（2.16×10 4 M -1） 1 M-1 ）（0.04）
  在饱和点-A A 492（样品X）处的ΔA 492nm /min测试 = A 492（样品X）在0分钟
  在饱和点的ΔA 492nm /min空白 = A 492nm（空白） - 在0℃的A 492nm（空白） min
  0.04 =稀释因子（10μl/250μl）
  为了计算比活性，将公式中得到的值除以样品中存在的蛋白质量（换算成mg/ml）。

食谱

蛋白提取工作溶液
0.25 M蔗糖 50 mM HEPES
3 mM EDTA
1 mM DTT
3.6mM L-半胱氨酸 0.1mM MgCl 2·h/v 0.6％PVP
10片，完整，微型，无EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片准备以下储备溶液：
1 M蔗糖
1 M HEPES（pH 7.2）
0.25 M EDTA
1 M DTT
100mM MgCl 2/v/v 在80ml水中加入以下试剂：

添加10片完整，微型，无EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片混合好，调整体积到100 ml

致谢

该协议已经被改编和修改以使用在拟南芥中，来自Jiang和Zhang（2002）。这项工作得到了Samuel Roberts Noble基金会的支持。

参考文献

Able，A.J.，Guest，D.I。和Sutherland，M.W。（1998）。使用的新的基于四氮唑的测定来研究超氧化物的生产通过用无毒游动孢子攻击的烟草细胞培养物的自由基 phytophthora parasitica var Nicotianae 植物生理学 491-499。
Jiang，M。和Zhang，J。（2002）。参与的血浆膜NADPH氧化酶在脱落酸和水中胁迫诱导的玉米幼苗叶片中的抗氧化防御。 215（6）：1022-1030。
Rojas，C.M.，Senthil-Kumar，M.，Wang，K.，Ryu，C.M.，Kaundal，A.and Mysore，K.S.（2012）。乙醇酸氧化酶调节本氏烟草中非宿主抵抗期间的反应性氧物质介导的信号转导，植物细胞 24（1）：336-352。
Sagi，M。和Fluhr，R。（2001）。由植物同系物的gp91（phox）NADPH氧化酶产生的超氧化物。通过钙和烟草花叶病毒感染调节活性。植物生理学 126（3）：1281-1290。