材料和试剂

手套和口罩（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：52817; Cardinal Health，Insta-Gard，目录号：AT7511-WE）
1.5 ml离心管（无菌）（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
宽口径吸头，0-200μl（Corning，Axygen ®，目录号：T-1005-WB-C）
薄壁PCR管（Fisher Scientific，目录号：14-230-225）
尖端，0.1-10μl，0.1-1ml（无菌）（Fisher Scientific，目录号：02-707-474; 02-707-480）
细胞撒布机（Fisher Scientific，目录号：08-100-11）
培养皿（100 x 15 mm）（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
15ml锥形无菌聚丙烯离心管（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM，目录号：339650）
无菌0.22μm过滤器（Corning，目录号：431219）
1毫升注射器（BD，目录号：309659）
健康的NIH Swiss小鼠（Harlan Laboratories Inc.，Indianapolis，IN）和Sprague-Dawley（SD）大鼠（Charles River Canada，St. Constant，QC）
用100％乙醇稀释的70％乙醇（商业醇，目录号：P016EAAN）
琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：16500500）
Tris-Acetate-EDTA（TAE）（50x储备液）（Fisher Scientific，目录号：BP13321）
SYBR Safe DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：S33102）
6x DNA上样染料（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0611）
1 kb Plus DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：SM1331）
GeneJET凝胶提取和DNA清除微量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：K0832）
PureLink基因组DNA微型试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：K182001）
Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1096）
Nextera XT DNA文库制备指数试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1002）
Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1096）
Nextera XT DNA文库制备指数试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1002）
Qubit TM 1x dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q33230）
PhiX控制组件（Illumina，目录号：FC-110-3001）
MiSeq试剂盒V3（Illumina，目录号：MS-102-3003）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S373-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285-500）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-500）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-500LB）
MacConkey琼脂（BD，目录号：212123）
Luria-Bertani（LB）肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
DNA Taq聚合酶与50mM MgCl2（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10342020）。
Oligo引物27F / 1492R（Weisburg等人，1991）
27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'
三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10297-018）
PCR级别的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9932）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：SS266-1）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（见食谱）
MacConkey琼脂（见食谱）
LB肉汤（请参阅食谱）
细菌分离物的甘油库存（见食谱）
PCR反应混合物（见食谱）
0.1 N NaOH（见食谱）

设备

镊子（用高压灭菌器灭菌）
涡旋（Fisher Scientific，目录号：02215365）
移液器[例如，P1000（Eppendorf，目录号：3120000062），P200（Eppendorf，目录号：3120000054），P10（Eppendorf，目录号：3120000020）]
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，型号：GeneAMP PCR System 9700）
微波炉（RCA，目录号：RMW733）
凝胶电泳系统（Fisher Scientific，型号：FB300）
具有照片文档的UV透照器（Azure Biosystems，型号：Azure c200）
培养箱（37°C）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：370型）
摇动培养箱（37°C）（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：I26）
Qubit TM 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q33216）
Qubit TM测定管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32856）。
Illumina MiSeq仪器（Illumina，型号：MiSeq TM系统，目录号：SY-410-1003）
高压灭菌器（Beta Star生命科学设备，型号：C2002BS）
-80°C冷冻箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM 900 Series，989）

程序

用于分离和识别肠共生的协议。来自实验室小鼠或大鼠粪便的大肠杆菌菌株包括粪便收集，细菌培养和菌落表征的步骤（图1）。

图1.从小鼠或大鼠粪便中分离和鉴定共生大肠杆菌的工作流程图

粪便收集
注意：个人防护装备包括手套和口罩是必需的。
1. 将健康的NIH Swiss鼠标/ SD大鼠放入干净的笼子并等待排便。
2. 使用无菌镊子将一个新鲜的粪便颗粒转移到预先装有1ml 1x PBS的1.5ml离心管中。
  注：推荐新鲜粪便颗粒的重量：小鼠，30-50毫克;大鼠，80-100毫克。
3. 将带有粪便颗粒的试管放在冰上，立即将它们转移回实验室进行连续稀释和电镀。
连续稀释和电镀
注意：戴上手套并使用70％乙醇作为消毒剂清洁工作台表面。
1. 通过以最大速度涡旋30秒来彻底均化粪便颗粒。
2. 将900μl1x PBS加入四个1.5 ml离心管中。
  使用大口径吸头对粪便样品进行1:10系列稀释。
3. 使用细胞涂布器将100μl的每种稀释液涂布到MacConkey琼脂平板（10 -1 -1至10 -5 -5）上。
4. 在37℃有氧培养板16-18小时。
用于E的菌落PCR。通过使用16S rRNA基因引物的Sanger测序鉴定大肠杆菌
1. 麦康凯琼脂是分离大肠菌群的选择性和差异培养基。潜力 E。由于能够发酵乳糖（图2），大肠杆菌菌落显示为红色和圆形菌落。选择潜在的菌落进行下列PCR扩增。
  
  图2. E的菌落形态。在MacConkey琼脂上生长后，从大鼠粪便中分离出来的大肠杆菌。大肠杆菌菌落呈红色，呈圆形。
  带有黑色箭头的殖民地被视为负面殖民地。
2. 每个PCR管中加入50μlPCR反应混合物（见配方）。
3. 使用P10提示在PCR反应中挑选少量单菌落和漩涡。通过上下移液来混合菌落和PCR反应，然后丢弃提示。
4. 按照PCR程序完成热循环仪中的反应（见注）。
5. 通过在1x TAE中溶解0.4g琼脂糖并加热（微波）来制备40ml的1％琼脂糖凝胶。将4μlSYBR Safe DNA凝胶染色液加入凝胶中并充分混匀。在装置中浇铸琼脂糖凝胶并等待凝胶凝固。将5μlPCR反应液与1μl6x DNA上样染料混合，并将样品以及标记（2μl，1 kb Plus DNA ladder）应用于凝胶。在100 V下运行电泳30分钟。拍摄照片，使用紫外透射仪检查扩增情况。
  比较PCR产物的大小（大约1,465bp）与标记物（图3）。
  
  图3.从六种细菌分离物扩增的16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1表示阴性对照，泳道2至7表示PCR产物扩增了所选细菌分离物的16S rRNA基因。 PCR产物的大小约为1465 bp。
6. 使用GeneJET凝胶提取和DNA清洁试剂盒按照生产商的说明进行PCR清洁。该步骤使用凝胶电泳后的剩余PCR混合物。调整浓度后，使用16S rRNA基因引物通过Sanger测序进一步对清理的样品进行测序。
7. 对核糖体数据库项目（RDP，发布11.4; http：//rdp.cem。）搜索16S rRNA基因序列。 msu.edu/ ）和NCBI核苷酸数据库（ https：// blast。 ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）（见数据分析）。
8. 选择与大肠杆菌的类型菌株具有高于98％16S rRNA序列同一性的分离物并在LB培养基（参见配方）中在振荡培养箱（37℃）中培养过夜以制备甘油库存（25％甘油，见食谱）保存。
全基因组序列和注释
1. 使用PureLink Genomic DNA Mini试剂盒按照生产商的说明将选定的分离物在5ml LB肉汤中培养过夜以进行基因组DNA提取。来自最后一步C8的LB培养物可用于DNA提取。
2. 全基因组测序是在Illumina MiSeq平台上进行的。根据制造商的说明使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒将分离的基因组DNA片段化以产生文库。
3. 根据制造商的说明，使用Qubit TM 1x dsDNA HS分析试剂盒，通过Qubit TM 3.0荧光计对产生的文库的浓度进行定量。将量化的文库进一步标准化至2nM，并按照Nextera XT DNA文库制备试剂盒的方案汇集。
4. 使用0.1N NaOH将合并的文库变性并与5％PhiX基因组DNA混合作为阳性对照。
5. 使用MiSeq试剂V3测序合成试剂盒在Illumina MiSeq仪器上进行变性文库的测序，产生2×300bp读数。
6. 基因组草图与SPAdes汇编程序汇编在一起（Bankevich et al。，2012）。基因组组装评估由基因组组装质量评估工具（QUAST）评估（Gurevich et al。，2013）。 BBMap的工具（Bushnell，2014）用于将原始回读映射回由SPAdes生成的重叠群，以获得有关重叠群覆盖率的信息。应用Megablast算法（Zhang等人，2000）将爆发重叠群对从NBCI获得的参考细菌基因组进行爆破。使用子系统技术的快速注释（RAST）（Aziz et。，2008）用于基因组注释。
7. IslandViewer（Dhillon等人，2015）用于预测E全基因组中的毒素相关毒力。 c。oli分离物。提交给IslandViewer的分离株的基因组格式为GENBANK。没有鉴定到基因组中毒素毒力因子（VF）相关基因命名的分离株被认为是共生的大肠杆菌分离株。

数据分析

经菌落PCR和Sanger测序后，将细菌分离株的16S rRNA序列与RDP和NCBI核苷酸数据库进行比对。 RDP数据库中的Seqmatch和分类器工具用于分配分类。在Seqmatch的环境中选择高品质的类型菌株序列（大小≥1,200 bp）。当对NCBI数据库进行检索时，“16S核糖体RNA序列”数据库（细菌和古细菌）被用作参考数据库，其默认设置。

笔记

热循环仪条件
94°C初始变性10分钟

35个循环，94℃30秒，58℃30秒，72℃1分40秒在72°C下最后延伸7分钟
保持在4°C

食谱

1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（1 L）
10mM Na 2 HPO 4 4/2 1.8mM KH 2 PO 4 4/2 137mM NaCl
2.7 mM KCl
用HCl调节pH值至7.4，使用前用过滤器或高压灭菌器灭菌
MacConkey琼脂
将50g粉末悬浮在1L ddH 2 O中。充分混合并煮沸1分钟以完全溶解粉末。在121°C高压灭菌15分钟。每个培养皿冷却并分配约20ml（直径100×15mm）。
在4°C储存长达一个月
LB肉汤
搅拌以将25g粉末悬浮在1L ddH 2 O中。在121°C高压灭菌15分钟以灭菌。
在4°C储存长达一个月
细菌分离株的甘油原种（在25％甘油中）
1. 准备100毫升的50％（v / v）甘油
  甘油（100％）50毫升
  将ddH <2> O加入100毫升
  高压灭菌器消毒
2. 从细菌分离物的肉汤培养物中制备甘油原液
  使用无菌移液枪头，将500μl细菌肉汤培养液移入无菌离心管中。
  加入500μl50％高压灭菌甘油。通过涡旋混合溶液并将管放入-80°C冰箱中。
PCR反应混合物
5μl10x PCR缓冲液（1x终浓度）
0.5μl1 U /μlTaq聚合酶
2μl的50mM MgCl 2 /
2μl的10μMOligo底漆27F
2μl10μMOligo底漆1492R
2μl的10mM dNTP混合物

用PCR级别的水加总量达50μl
0.1 N NaOH溶液
用无核酸酶的水将1N NaOH（Fisher Scientific）1:10稀释。例如：在无菌15 ml离心管中，将9 ml无核酸酶的水加入1 ml 1 N NaOH溶液中。通过涡旋混合溶液并通过使用注射器通过0.22μm过滤器过滤进行灭菌

致谢

这项研究得到了B.P.W所持有的自然科学和工程研究委员会发现赠款的支持。 T.J.由加拿大阿尔伯塔省Alberta Innovates-Technology Futures的研究生奖学金提供支持。 B.P.W.由加拿大研究主席计划提供支持。该协议摘自Ju et al。，2017年。作者没有利益冲突声明。

参考

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