材料和试剂

物料
1. 移液器吸头
2. 1.5 ml Bioruptor Pico Microtubes with Caps（Diagenode，目录号：C30010016）
3. Illumina NextSeq 500中等输出KT v2（150个周期）（Illumina，目录号：FC-404-2001）
  注意：研究人员应该为他们的实验规格选择最合适的流通池。为了对KSHV基因组上的精氨酸甲基化进行测序，这个特定的流动细胞已经足够了。
化学品/储备溶液
1. 蛋白酶抑制剂（亮肽素，抑肽酶，氟化钠，胃蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟）（Sigma-Aldrich，目录号：S8830）
2. Pierce 16％甲醛（w / v），无甲醇（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：28906）
3. 1 M甘氨酸
4. Bioruptor Pico超声珠（Diagenode，目录号：C01020031）
5. RNA酶A，20mg / ml
6. 1.5％琼脂糖凝胶
7. 特定ChIP级抗体
  注：为了定量KSHV基因组上的H4R3me2s，使用了以下ChIP级抗体：兔抗H4R3me2（活性基序，目录号：61187），兔抗组蛋白H4（活性基序，目录号：61299），兔抗 - 对照IgG（ChIP级 - 细胞信号传导技术，目录号：2729）。
8. 1x TE
9. 5 M NaCl
10. 7.5 M醋酸铵
11. 100％乙醇
12. GlycoBlue共沉淀剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9516）
13. 蛋白酶K
14. QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
15. Qubit dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32851）
16. NEXTflex TM ChIP Seq试剂盒（Illumina兼容）（Bioo Scientific，目录号：NOVA-5143-02）
17. NEXTflex TM ChIP Seq条形码-12（Illumina兼容）（Bioo Scientific，目录号：NOVA-514120）
18. KAPA Library Quantification Complete Kit（Universal），试剂盒编码KK4824（Kapa Biosystems，产品目录号：07960140001）
19. 安捷伦生物分析仪高灵敏度DNA芯片试剂盒（安捷伦科技公司，产品目录号：5067-4626）
20. 0.5 M PIPES，pH 8.0
21. 1.7 M KCl
22. 10％Nonidet-P40（NP-40）
23. 0.5M EDTA，pH8.0
24. 1 M Tris-HCl pH 8.1
25. 磁蛋白A和G珠子
  1. 蛋白A Mag Sepharose（GE Healthcare，目录号：28944006）
  2. 蛋白G Mag Sepharose（GE Healthcare，目录号：28944008）
26. 剪下的10mg / ml鲑鱼精子DNA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9680）
27. 10％Triton X-100
28. 10％SDS
29. 1M NaHCO 3
缓冲区
1. 1xPBS（137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH7.4）
2. 缓冲液D染色质剪切缓冲液（Diagenode，目录号：C01020030）
3. 细胞裂解缓冲液（见食谱）
4. ChIP稀释缓冲液（见食谱）
5. ChIP磁性A + G珠（见食谱）
6. ChIP低盐洗（见食谱）
7. ChIP洗脱缓冲液（见食谱）

设备

移液器
台式Eppendorf离心机，冷藏和非冷藏
Bioruptor®Pico声处理设备（Diagenode，目录号：B01060001）
磁座
水浴
管旋转器
热循环仪
Qubit荧光计（赛默飞世尔科技）
Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，型号：Agilent 2100，目录号：G2939BA）
定量PCR仪
漩涡
Illumina NextSeq 500（Illumina，型号：NextSeq 500）
注意：用于这些研究的Illumina NextSeq机器是内华达州基因组学中心的财产，该中心为本研究执行所有测序运行。

软件

CLC工作台10.0.1（许可来自德国马里兰州Germantown的QIAGEN）

程序

染色质免疫沉淀分析
1. 收获大约2000万个细胞并离心成颗粒。吸出培养基，然后重悬于含有蛋白酶抑制剂（1μg/ ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ ml抑肽酶，1μg/ ml氟化钠，1μg/ ml胃酶抑素和1mM苯甲基磺酰氟）的5ml冰冷PBS中，并重悬于离心机再次洗涤细胞。
2. 将细胞沉淀重新悬浮于PBS中的10ml 1％甲醛中，室温孵育10分钟，轻轻摇动。
  注意：如果使用16％无甲醛的甲醛溶液，将1 ml + 15 ml PBS混合以获得1％甲醛溶液以交联细胞。
3. 立即将甘氨酸加入终浓度为125 mM的样品中以终止交联反应，并在室温下摇动样品5分钟。
  注意：对于10ml交联细胞悬液，加入1.25ml 1M甘氨酸以获得125mM的终浓度。
4. 将细胞以70μgxg离心5分钟，再用5ml含蛋白酶抑制剂的冰冷PBS洗涤一次。
5. 从细胞沉淀中吸出PBS并将细胞重悬于1ml细胞裂解缓冲液[5mM哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）-KOH（pH8.0）-85mM KCl-0.5％NP-40;配方1]补充蛋白酶抑制剂并在冰上孵育10分钟。
6. 在4℃下800×g离心5分钟以收集细胞核，从细胞团中吸出上清液。
7. 同时，通过适当添加约100mg Bioruptor超声处理珠和标记管来制备1.5ml超声处理管。
8. 用缓冲液D染色质剪切缓冲液（Diagenode Inc.）重悬沉淀，用Bioruptor Pico仪器（Diagenode Inc.）准备染色质剪切。对于2000万个细胞，将细胞核重悬于1.8ml缓冲液D中，并将300μl分配到6个制备的超声处理管中。
9. 使用Bioruptor Pico超声处理装置进行超声处理，每个循环30秒/ 30秒使用开/关时间进行60个循环。
  注意：超声参数可以进一步优化条件以获得理想的染色质剪切，其中获得约300bp长的片段。有关优化超声处理效率的进一步建议，请参阅Diagenode手册。
10. 用4,000×g 离心超声处理管在台式离心机中1分钟以除去细胞碎片并将上清液转移到清洁的管中。超声处理后上清液应清除干净。如果需要，可以从该步骤中取少量15-20μl等分试样并用1μlRNase（20mg / ml原液）处理30分钟，然后通过在65℃孵育至少4小时来逆转交联，或者过夜并在1.5％琼脂糖凝胶上解析以检查剪切效率（参见图3的剪切结果实例）。
  
  图3. KSHV阳性细胞系的染色质剪切泳道1,100bp标记。泳道2-5是来自TRExBCBL1-RTA细胞的剪切对照，泳道2和4是潜在未诱导样品，泳道3和5是裂解活化的细胞。泳道2和3在ChIP测定中表现出有效的剪切作用，而泳道4和5显示出一些对于ChIP-Seq测定而言太大的残余DNA片段（涂抹）。泳道2和3使用Bioruptor Pico Pico剪切30秒开/关循环60分钟;
  使用相同的参数剪切4-5线，但时间较短（30分钟）。
11. 加入1-3倍体积的ChIP稀释缓冲液（1.2mM EDTA，16.7mM Tris，pH8.1,167mM NaCl和蛋白酶抑制剂;方案2）以剪切染色质样品并将体积分成两份，一份用于IgG对照ChIP，其他用于特异性抗体。
  注：对于来自KSHV细胞的H4R3me2s ChIP，我们使用3倍稀释的ChIP稀释缓冲液和2μg特异性抗体。取决于抗体效率，剪切染色质的较低稀释度（1倍或2倍体积的ChIP稀释缓冲液）可用于ChIP测定。
12. 预先清除样品并加入15μl/ ml ChIP磁性A + G珠（配方3），并在4℃下旋转30分钟。
  注意：如果抗体特异性非常好，则可以省略预清除步骤，但是为了减少进行ChIP-Seq时IgG样本中的背景信号，我们建议保留此步骤。
13. 保留10％的ChIP裂解物用于输入部分，将样品储存在4°C。
14. 将磁珠收集到磁力架上并将ChIP裂解物转移至新鲜试管中。加入IgG或特异性抗体（2μg或根据供应商的说明）并在4°C下旋转芯片样品。
15. 第二天，通过加入25μl/ ml ChIP磁性A + G珠并收集DNA-蛋白质复合物并在4℃下旋转2小时。
16. 用1ml ChIP低盐洗涤缓冲液（0.1％SDS-1.0％Triton X-100-2mM EDTA-20mM Tris [pH8.1] -150mM NaCl;配方4）洗涤ChIP样品各3次，并用1x TE。
  注意：请参阅图4以了解磁珠清洗程序的可视表示。
  
  图4.磁珠清洗程序。：一种。用洗涤缓冲液轻轻颠倒磁珠浆液，以均匀混合并清洗珠子。 B.将样品放置在磁性架上，静置直到浆液显得清澈，因为所有磁珠都沉积在靠近磁铁的管道边缘。小心地从珠子中除去上清液并进行进一步的洗涤或DNA洗脱步骤。该方法去除了在测序期间造成背景噪声的松散结合的非特异性DNA片段。
17. 通过加入150μl新制备的洗脱缓冲液（1％SDS-0.1M NaHCO 3 3;配方5）从磁珠洗脱染色质复合物并非常温和地涡旋15分钟。
  使用磁力架收集洗脱液并将上清液转移到清洁管中。
  注意：为了洗脱，将旋涡器设置为最低速度并保证样品连续涡旋15分钟。或者，样品可以旋转15分钟以达到相同的轻微搅动效果。洗脱步骤必须在室温下进行。
18. 重复步骤A17共2个洗脱步骤，并且总共300μl洗脱的染色质。另外，将ChIP输入样品加入到300μl的总体积中，如果需要的话加入洗脱缓冲液。
19. 通过加入18μl5M NaCl（0.3M NaCl终浓度）和1μlRNase A（10mg / ml）反向交联，并将样品在65℃孵育至少4小时或过夜。
  注意：如果反向交联时间较短（4 h），我们建议在65°C水浴中孵育样品以确保有效加热样品。如果在一夜之间反转交联，设置为65°C的杂交炉就足够了。
20. 反向交联完成后，通过加入1/15体积7.5M乙酸铵和2体积100％乙醇并在-80℃温育至少30分钟来沉淀样品。
  注意：我们建议在此阶段向样品中加入一种共沉淀剂，如1微升GlycoBlue，以便更容易地观察颗粒。
21. 在4℃台式离心机中以最大速度离心15分钟以沉淀DNA。
  。将管子打开半干燥约5分钟
22. 用100μl1x TE重悬沉淀，加2μl蛋白酶K（10 mg / ml），45°C孵育2 h。
23. 根据制造商的说明使用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA。
  注意：或者，可以在该步骤中进行苯酚 - 氯仿提取，并且可以如步骤A20那样沉淀所产生的DNA。然后向每个样品中加入1ml 70％乙醇，以最大速度离心，4℃15分钟，弃去乙醇，重复总计3次洗涤。让DNA颗粒短暂风干，然后重新悬浮于20-30μl无核酸酶水中进行文库制备和测序。
24. 按照制造商的说明使用Qubit高灵敏度DNA荧光计定量DNA浓度。简而言之，将Qubit dsDNA HS试剂与适当体积的Qubit dsDNA HS缓冲液混合以制备Qubit dsDNA HS工作溶液。将1μl样品与199μlQubit dsDNA HS工作溶液混合，并将含有样品的管放入机器中读取显示原始1μl样品浓度的读数。一旦确定了DNA样本的浓度，请继续进行文库准备。
ChIP文库制备：NEXTflex TM ChIP-Seq试剂盒（Illumina兼容）（Bioo Scientific Corp.）
为了量化病毒KSHV基因组上H4R3me2s的富集，我们使用了10ng ChIP /输入DNA，并选择遵循制造商说明的'选项3'准确地用于文库制备。 ChIP-Kit协议简要概述如下：
1. 末端修复DNA样本，在这一步骤中，DNA末端被钝化并被5'磷酸化。
2. 使用磁珠将300bp以上和400bp以下的DNA片段丢弃，而将300-400bp长的片段纯化以用于下一步文库制备。
3. 3'腺苷酸化，在这个步骤3'末端是A尾。
4. 适配器连接，在此步骤中，将特定的条形码DNA序列连接到测序样品以丰富下游的文库浓度并实现多路测序运行。
5. 清理，在这一步骤中，将连接有条形码的DNA序列纯化以备下一步骤之用。这对去除多余的衔接子序列或衔接子二聚体非常重要，这会不利于破坏协议中下一个PCR步骤。
6. PCR扩增，在此步骤中进行PCR以富集接头连接产物。为了减少PCR偏差，建议尽可能少的循环次数。
  注：对于文库制备PCR扩增，试剂盒步骤F3,16重复循环用于制备我们先前研究中使用的文库，'KSHV编码的ORF59调节病毒基因组的组蛋白甲基化以促进病毒再活化'。根据试剂盒的建议，PCR循环次数可根据原料浓度和数量进行优化。
7. 清理，这是库准备协议的最后清理和净化步骤。我们建议使用23μl重悬缓冲液进行最终洗脱，并收集20μl最终样品，而不是试剂盒说明书（33μl重悬缓冲液，收集30μl最终样品），因为这会产生更浓缩的终产物。
ChIP库验证和量化
1. 为了评估文库质量，我们建议使用安捷伦生物分析仪并运行高灵敏度DNA芯片。正确准备的文库产生一个大小约为300-350 bp的条带。
2. 为了准确量化文库样本浓度，我们建议使用KAPA文库量化试剂盒并严格按照制造商的说明操作。精确定量文库浓度对于优化聚类和在测序运行过程中使每个样本的读数数量最大化至关重要。
测序
1. 高覆盖率测序意味着每个碱基都被更大程度的对齐序列读取所覆盖，因此碱基识别电位具有更高的置信度。根据Illumina的说明，ChIP-Seq应用推荐使用约100倍的覆盖率。新一代测序是一种高度标准化的验证过程，我们建议遵循规定的程序。
2. 有关下一代测序深度和覆盖范围的更多信息，可以遵循制造商的建议。 Illumina的建议可以通过 https://www.illumina.com/science/education /sequencing-coverage.html 了解这些重要注意事项的详细说明。

数据分析

由NextSeq（Illumina，San Diego，CA）产生的FastQ数据被注释并且使用CLC workbench 10.0.1（QIAGEN，Germantown，MD）分析序列读数。序列读数是从内华达基因组学中心上传的Illumina Base Space库下载的。这些文件可以通过互联网导入序列分析软件，在我们的案例中使用“导入Illumina读取”选项的CLC Workbench。
从输入的对照IgG抗体和特异性抗体样品获得的读数使用CLC工作台的'参照'参考'操作映射到KSHV基因组。
在使用CLC Workbench的'ChIP-seq'工具与各自的输入样品峰进行比较后，对映射的读数进行识别ChIP样品中的富集峰。相对富集呈现为使用0.05的最小呼叫峰值计算得到的峰值分数。（请参阅' KSHV编码的ORF59调节病毒的组蛋白精氨酸甲基化基因组以促进病毒再活化'，由Strahan等人于2017年在PLoS Pathogens公开提供）。
评估KSHV病毒基因组上染色质标记相对丰度的唯一挑战是，尽管每个样品的测序深度都很高，但只有约1％的ChIP-Seq读数与病毒基因组相对应。这说明了深度测序覆盖评估病毒染色质构象的重要性。

食谱

细胞裂解缓冲液，50毫升
500μl0.5 M PIPES，pH 8.0
2.5毫升1.7 M KCl
2.5毫升10％NP-40
无菌ddH 2 O至50毫升，室温储存

在使用前加入新鲜的蛋白酶抑制剂
ChIP稀释缓冲液，50毫升
125μl0.5 M EDTA pH 8.0
835μl1 M Tris-HCl pH 8.1
1.67毫升5M NaCl
无菌ddH 2 O至50毫升，室温储存

在使用前加入新鲜的蛋白酶抑制剂
ChIP磁性A + G珠子
1. 将300μlProtein A磁珠与300μlProtein G磁珠合并，并用1×TE 3次洗涤注意：将试管置于磁力架上，取出上清液，从磁力架上取下，加1 ml TE，重复。
2. 用1 mg / ml超声处理过的鲑鱼精子DNA和1 mg / ml BSA在1x TE中重悬珠浆并在4°C下旋转过夜。
  注意：超声波处理的鲑鱼精子DNA被用作阻断剂以减少非特异性背景DNA结合。
3. 第二天，用TE洗珠1次，然后以500μlTE的终体积重新悬浮，珠子现在可用于ChIP测定。
ChIP低盐洗，50毫升
5毫升10％Triton X-100
500μl10％SDS
200μl0.5 M EDTA pH 8.0
1毫升1M Tris-HCl pH 8.1
1.5 ml 5 M NaCl
无菌ddH 2 O至50毫升，室温储存
在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂并储存在冰上
洗涤步骤后丢弃
ChIP洗脱缓冲液
1毫升10％SDS
1ml 1M NaHCO 3（新鲜制备）
无菌ddH 2 O至10毫升，在室温下储存并在使用后丢弃过量

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院（CA174459和AI105000）的支持。该协议适用于从先前的ChIP-Seq方案和Diagenode Inc.的LowCell号ChIP方案的组合中确定H4R3me2s在KSHV基因组上的富集。作者想感谢来自内华达州基因组学中心（University of内华达州，里诺，美国）进行Illumina测序运行。
利益冲突：作者声明不存在利益冲突和利益冲突，这可能会影响上述协议的设计和实施。

参考

Aneja，K. K.和Yuan，Y.（2017）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒的重新激活和裂解复制：更新 Front Microbiol 8：613.
Bannister，A.J。和Kouzarides，T。（2011）。通过组蛋白修饰调节染色质 Cell Res 21 （3）：381-395。
Bedford，M.T。和Clarke，S.G。（2009）。哺乳动物中的蛋白质精氨酸甲基化：谁，什么，为什么。 Mol细胞 33：1-13。
Bernstein，B.E.，Meissner，A。和Lander，E.S。（2007）。哺乳动物表观基因组。 Cell 128（4）： 669-681。
Cesarman，E.，Chang，Y.，Moore，P.S.，Said，J.W。和Knowles，D.M。（1995）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒样DNA序列与艾滋病相关的体腔淋巴瘤相关。 / N> N Engl J Med 332（18）：1186-1191。
Chang，Y.，Cesarman，E.，Pessin，M.S.，Lee，F.，Culpepper，J.，Knowles，D.M。和Moore，P.S。（1994）。艾滋病相关卡波西肉瘤中疱疹病毒样DNA序列的鉴定科学 266（5192）：1865-1869。
Di Lorenzo，A.和Bedford，M.T。（2011）。组蛋白精氨酸甲基化 FEBS Lett 585（13）：2024-2031。
Gunther，T。和Grundhoff，A。（2010）。潜伏性卡波西肉瘤相关疱疹病毒基因组的后生景观 PLoS Pathog 6（6）：e1000935。
Nakamura，H.，Lu，M.，Gwack，Y.，Souvlis，J.，Zeichner，S.L。和Jung，J.U.（2003）。表达四环素诱导型Rta反式激活因子后卡波西氏肉瘤相关病毒基因表达模式的全球变化。
Pahlich，S.，Zakaryan，R.P.和Gehring，H。（2006）。蛋白质精氨酸甲基化：细胞功能和分析方法。 Biochim Biophys A cta 1764：1890-1903。
Park，P.J。（2009）。 ChIP-seq：成熟技术的优点和挑战 Nat Rev Genet 10（10）：669-680。
Purushothaman，P.，Dabral，P.，Gupta，N.，Sarkar，R.和Verma，S.C。（2016）。 KSHV基因组复制与维护 Front Microbiol 7： 54.
Purushothaman，P.，Uppal，T.和Verma，S.C。（2015）。 KSHV裂解再激活的分子生物学病毒 7（ 1）：116-153。
Russo，JJ，Bohenzky，RA，Chien，MC，Chen，J.，Yan，M.，Maddalena，D.，Parry，JP，Peruzzi，D.，Edelman，IS，Chang，Y。和Moore，PS ）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（HHV8）的核苷酸序列。 Proc美国国家科学院院刊93：14862-14867。
Soulier，J.，Grollet，L.，Oksenhendler，E.，Cacoub，P.，Cazals-Hatem，D.，Babinet，P.，d'Agay，MF，Clauvel，JP，Raphael，M.，Degos，L 。和等人（1995）。卡氏肉瘤相关疱疹病毒样DNA序列在多中心Castleman病中血液 86（4）：1276-1280。
Strahan，R.C.，McDowell-Sargent，M.，Uppal，T.，Purushothaman，P.和Verma，S.C。（2017）。 KSHV编码的ORF59调节病毒基因组的组蛋白精氨酸甲基化以促进病毒再激活。 < PLoS Pathog 13（7）：e1006482。
Toth，Z.，Brulois，K。和Jung，J.U.（2013）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒的染色质景观病毒 5（5）：1346-1373。
Toth，Z.，Brulois，K.，Lee，H.R.，Izumiya，Y.，Tepper，C.，Kung，H.J。和Jung，J.U.（2013）。重新感染后KSHV基因组上的双相常染色质 - 异染色质转换 < PLoS Pathog 9（12）：e1003813。
Toth，Z.，Maglinte，D.T.，Lee，S.H.，Lee，H.R.，Wong，L.Y.，Brulois，K.F.，Lee，S.，Buckley，J.D。，Laird，P.W.，Marquez，V.E.and Jung，J.U.（2010）。 KSHV潜伏和裂解基因组的表观遗传学分析 PLoS Pathog 6（7）：e1001013。
Uppal，T.，Banerjee，S.，Sun，Z.，Verma，S.C。和Robertson，E.S。（2014）。 KSHV LANA - KSHV延迟的主要监管机构病毒 6（12）：4961-4998。
Uppal，T.，Jha，H.C.，Verma，S.C。和Robertson，E.S。（2015）。 KSHV基因组在KSHV生命周期中的染色质化癌症（巴塞尔） 7（1）：112-142。
Zhang，T.，Cooper，S.和Brockdorff，N。（2015）。组蛋白修饰的相互作用 - 阅读的作者 EMBO Rep 16（11）：1467-1481。