材料和试剂

1. 3M TM Micropore TM医用胶带（3M，Micropore TM TM，目录号：1530-1）
反应管，1.5毫升（Greiner Bio One International，目录号：616201）
150 x 25毫米（d x h）塑料培养皿（SPL Life Sciences，目录号：10151）
比色杯（Ratiolab，产品目录号：2712120）
拟南芥种子
乙醇（Merck，EMSURE ®，目录号：1009831011）
液氮
亚硝酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P8394）
Murashige＆amp; Skoog培养基包括维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0222）
MES一水合物（Duchefa Biochemie，目录号：M1503）
氢氧化钾（Merck，目录号：814353）
蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1001）
Tris-HCl（Duchefa Biochemie，目录号：T1513）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1003）
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物（FAD-Na 2）（Sigma-Aldrich，目录号：F8384）
二硫苏糖醇（DTT）（Duchefa Biochemie，目录号：D1309）
牛血清白蛋白（BSA）（Merck，Probumin，目录号：821006）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
硝酸钠（NaNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5506）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Bio Basic，目录号：S0404）
磷酸二氢钠无水（NaH 2 PO 4）（Bio Basic，目录号：SB0878）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：43420）
盐酸（HCl）（DAEJUNG CHEMICAL＆amp; METALS，目录号：4090-4405）
磺胺（Sigma-Aldrich，目录号：S9251）
N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：222488）
MS琼脂培养基（见食谱）
提取缓冲液（见食谱）
反应缓冲液（见食谱）
1％磺胺溶液（见食谱）
0.05％N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐（见配方）

设备

移液器试剂盒（Gilson，型号：PIPETMAN Classic Classic，产品目录号：F167300）
2L烧瓶（DWK Life Sciences，Duran，目录号：21 216 63）
拟南芥生长室（Hanbaek，型号：HB-301L-3）
不锈钢镊子
砂浆＆amp;杵（Silico＆amp; Chemico Porcelain Works，目录号：J-753）
离心机（Thermo Fisher科学公司，型号：Sorvall TM Legend TM 17，目录号：75002431）
分光光度计（Biochrom，型号：Libra S22）
磁力搅拌器（Vision Scientific，型号：VS-130SH）
搅拌棒
pH计（Fisher Scientific，型号：accumet TM TM AB15）
高压灭菌器（Hanbaek，型号：HB-506-6）

程序

植物准备
1. 用70％乙醇消毒拟南芥种子三次。
2. 将种子铺在含有0.75％琼脂的Murashige和Skoog（MS）培养基（见食谱）上。
3. 将3M微孔胶带缠绕在每块MS板的周围，并将板在黑暗中4℃保存2天。
4. 2天后，在长日照条件下（16小时，22℃光照/ 8小时，20℃黑暗条件下），将平板移至全自动生长室。
组织提取
1. 15天后，使用不锈钢镊子取出感兴趣的组织（0.5克鲜重）。
2. 将样品冷冻在液氮中。
3. 使用冷冻研钵和研杵在液氮中研磨样品。
4. 加入750μl冷冻提取缓冲液（见配方）到研磨样品中均匀化
5. 通过移液管将匀浆收集到新的1.5 ml管中。
6. 在17,000×g的条件下离心5分钟。
7. 收集上清到新的1.5毫升管和丢弃颗粒。
硝酸还原酶酶试验
1. 在150 ml反应缓冲液中加入150μl上清液（见配方）注意：反应缓冲液含有底物（硝酸盐）和NADH以引发反应。
2. 在室温下孵育2小时注意：要空白，跳过孵化程序并执行下一步。
3. 加入200μl1％对氨基苯磺酰胺和200μl0.05％N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐，通过移液停止反应。
4. 在室温下孵育15分钟。
测量吸光度
1. 将1毫升反应混合物转移到比色杯中。
2. 测量540 nm处反应混合物的吸光度。
亚硝酸盐标准曲线的制备
1. 使用亚硝酸钾（0,5,10,20和40μM）在1,250μl0.6x稀释的提取缓冲液（加入500μlddH 2 O至750μl提取物中）中制备亚硝酸盐稀释系列缓冲区）。
  注：标准提取缓冲液的稀释比例是基于1mg鲜重具有约1μl体积的假设来确定的。
2. 在150 ml反应缓冲液中加入150μl稀释系列（见配方）
3. 加入200μl1％磺胺和200μl0.05％N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐。
4. 在室温下孵育15分钟。
5. 将1毫升反应混合物转移到比色杯中。
6. 测量540 nm处反应混合物的吸光度。
7. 为已知的亚硝酸盐浓度生成标准曲线。
废物处理
1. 所有的废物必须按照联邦，州和地方的环境控制法规进行处理。

数据分析

从这个协议获得的价值是亚硝酸盐分子的数量。因此，计算NR活动如下：
ΔA= A sample - blank
每个样品一式三份，ΔA值从三份平均值中减去空白。
ΔA值表示在2小时培养时间内产生的亚硝酸盐浓度增加（参见步骤C2），并且其可以用作NR活性的可比较尺度。对于想要获得准确增加的亚硝酸盐浓度的人，请使用标准曲线计算浓度变化。样品中亚硝酸盐含量增加的比例（nmol NO 2 - g -1 -1 FW h -1）使用公式如下：
[亚硝酸盐浓度（μM）的变化]×[提取体积（ml）] / [鲜重（g）] / [反应时间（h）]

食谱

MS琼脂培养基
4.4克Murashige Skoog基础盐混合物和0.5克MES一水合物在1升去离子水中
用5 M KOH调节pH至5.8 加10克蔗糖
添加7.5克植物琼脂

在121°C高压灭菌15分钟将介质存放在室温下
将介质倒入150 x 25毫米（d x h）的塑料培养皿中。
浇注电镀可以在4°C储存
提取缓冲区
250 mM Tris-HCl（pH 8.0）
1 mM EDTA
1μMNa 2 MoO 4 4/2 5μM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）
3毫米二硫苏糖醇
1％BSA
12 mM 2-巯基乙醇
250μMPMSF
注意：提取缓冲液应该准备新鲜，立即使用并储存在冰上。
反应缓冲液
40mM NaNO 3 /
80mM Na 2 HPO 4 4/2 20mM NaH 2 PO 4（pH 7.5）
0.2 mM NADH
注意：不含NADH的反应缓冲液可以在4°C下保存数月。由于添加了NADH，缓冲区应立即使用。
1％磺胺溶液
溶于3M HCl
注意：此解决方案在几个月内保持稳定。
0.05％N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐
溶于蒸馏水。将溶液储存在黑瓶中
注意：此解决方案在1个月内保持稳定。

致谢

这项工作得到了大韩民国农村发展管理局下一代BioGreen 21项目（植物分子育种中心PJ01327601）的资助。
如前所述（Samuelson和Larsson，1993; Yu等人，1998，Hachiya和Okamoto，2016）对该协议进行了修改和修改。作者声明他们没有利益冲突。

参考

Croy，L.I。和Hageman，R.H。（1970）。硝酸还原酶活性与籽粒蛋白质产量的关系在小麦中。 <作物科学 10（3）：280-285。
Dalling，M.和Loyn，R。（1977）。苗期硝酸还原酶活性水平可作为小麦籽粒氮产量的预测指标（ Triticum aestivum L.） Aust J Agr Res 28（1）：1-4。
Hachiya，T.和Okamoto，Y。（2016）。简单的光谱测定拟南芥中的硝酸盐，亚硝酸盐和铵。 Bio-protocol 7（10）：e2280。
Park，B.S。，Song，J.T。和Seo，H.S.（2011）。拟南芥硝酸还原酶活性受E3 SUMO连接酶AtSIZ1刺激。 / a> Nat Commun 2：400.
Ruan，J.，Wu，X.，Ye，Y.和Härdter，R。（1998）。 Sci Food Agr 76（3）：389-396。
Samuelson，M.E和Larsson，C.M。（1993）。大麦根中zeation riboside水平的硝酸盐调节：N同化抑制剂的作用和与铵的比较。植物科学 93（1-2）：77-84。
Yu，X.，Sukumaran，S。和Mrton，L。（1998）。拟南芥Nia1 和 Nia2 的差异表达>基因。细胞分裂素诱导的硝酸还原酶活性与增加的nia1转录和mrna水平相关。“植物生理学”116（3）：1091-1096。