材料和试剂

小鼠（从法国Le Genest-Saint-Isle的Janvier Labs购买的C57BL6 / N小鼠）
注：如果在PPI性能之前应用药理学处理，则试剂将取决于所制备的对照或药物溶液。根据测试前应用的处理方式，动物可以安置在单笼或笼笼中。
70％乙醇

设备

具有数字化电子输出的SR-LAB惊奇设备（SR-Lab，San Diego Instruments，目录号：2325-0400）（图1）
数字声级计（FLIR Systems，Extech，目录号：407730）

图1. SR-LAB惊吓装置。：一种。每个实验装置由一个外部照明和通风室组成，用于防止外部噪音或振动干扰实验。 B.在腔室内部，由有机玻璃圆柱体组成的稳定仪固定在平台上。 C.压电式加速度计 - 由红色箭头指示 - 安装在圆柱体下方，可转换动物运动，然后将其数字化，校正并通过计算机和接口组件进行记录。根据所需的设置，扬声器 - 由蓝色箭头指示 - 生成令人吃惊的声音刺激。

软件

SR-Lab分析软件（SR-Lab San Diego Instruments，目录号：2325-0400）

程序

设计协议
在这里，我们描述了在实验室中用于研究小鼠PPI反应的实验设计（Busquets-Garcia等，2017），但协议可以通过调整脉冲和前脉冲强度来修改，试验次数，试用间隔时间等，适合探索不同的实验问题。
1. 以5分钟的适应期开始训练。在适应期间，为了适应动物持有者，惊吓盒和背景噪声，呈现70-dB白噪声的恒定背景噪声。
2. 然后，本次会议通过90个不同的试验（图2）进行演示：＆nbsp;
  
  图2.使用描述的实验设计的代表性会话。前五项试验包括5项单独脉冲试验（A），中间80项试验分为10组随机脉冲单独试验，单独前脉冲试验，前脉冲试验组合和无刺激试验试验（B），本次会议结束时连续5次连续脉冲单独试验（C）。预冲强度（73 dB，76 dB和82 dB）高于70 dB背景。
  1. 前五个试验包括五个脉冲单独试验，其中120分贝的白噪声在20毫秒的持续时间内独立出现（，没有预脉冲）。这些试验有助于习惯和稳定动物惊吓反应。
  2. 随后，提出了十块试验。每个模块包括一个单独的脉冲试验，三个单独的单脉冲试验（70分贝背景上+3，+6或+12单位），三个脉波试验组合和一个无刺激试验（<即时，仅限背景）（表1）。 8个试验在每个区块内以随机顺序呈现，试验间期（ITI）在10至30秒内随机变化，旨在最大限度地减少习惯，以便在试验中惊醒。
    备注：
    1. 随机ITIs的优势在于动物不能预测下一次刺激呈现将发生的时间。例如，注意前脉冲可以增加动物抑制惊吓反应的效力。应避免10秒以下的ITI，以排除肌肉疲劳和肌肉反应不应期造成的影响。
    2. 预脉冲的强度应保持在背景噪声以上的水平，但也足够低，以至于它们本身不会引起显着的惊吓反应，边界大约高于背景水平2-20分贝（例如+3 ，高于70dB背景的+6或+12dB）。重要的是要注意，对前脉冲的敏感度也可能因应变，性别或动物年龄而异。
      
      表1.在行为协议中使用的不同类型的试验的表示形式
  3. 在第一个区块中，会议以最后一个连续五个脉冲单独试验结束。
    注：刺激的上升时间，持续时间和强度是影响惊恐反射幅度的变量（Graham，1975; Hoffman和Searle，1968）。考虑到动物的品系，年龄，性别和遗传背景，所有参数都应仔细确定，因为不同的品系可能会对惊吓刺激产生不同的反应（Willott等，1995和2003）。＆nbsp;
运行实验
1. 校准惊吓腔的传感器平台的扬声器和灵敏度（图3）。按照制造商的指导进行有效的声音和移动校准。
  注：声音和运动传感器的校准对于获得有效的测试结果非常重要。因此，必须在每次实验前对这些进行常规校准。＆nbsp;
  
  图3.用于校准惊吓腔的扬声器（A）和运动灵敏度检测器（B）的代表性图像
2. 创建了您的实验方案（A1，A2）后，您可以使用SR-LAB惊吓仪器软件创建研究数据库，定义实验会议和将要测试的主题。
3. 运送老鼠到测试室。您可以同时测试多少个小鼠，可以使用多少个小室（软件最多可容纳16个小室）。关于住房条件，请参阅注释1。在开始实验之前，请小心不要给小鼠施压，并且为此，至少24小时之前不要对家笼（ eg ，铺垫）进行更改本实验。测试室内的照明和噪声水平应该与住房中的水平相当，以尽量减少环境对行为结果的影响。
  。管状动物外壳可以最大限度地减少压力，同时动物仍然集中在传感器上，以获得稳定可靠的结果。
4. 在每个实验环节中，将鼠标放在测试室内的圆筒内，并关上门。
5. 根据上述实验设计运行实验会话。会话将在协议结束时自动停止（约35-40分钟后）。
6. 在实验结束时将每只小鼠从小室中取出并放回家中的笼子中。
  。在使用下一个动物之前，用水清洁动物支架和小室并让其干燥。
7. 在屏幕上选择下一个会话并对所有动物重复该过程。
8. 在所有会议结束时，用70％乙醇清洁圆柱体和腔室，并使其干燥。保存获得的数据，以便对声学惊恐和声学预脉冲抑制反应进行后续详细分析。

数据分析

可以分别分析在五个连续脉搏单独试验的第一个和最后一个块上获得的反应性评分，以评估惊吓习惯。从其余80个试验中获得的数据根据其与不同行为构建的相关性分为三个不同的子集。
首先，从脉冲单独试验中获得的反应性评分（不包括五个连续脉冲单独试验的第一个和最后一个试验）评估惊恐反应性（S）。通过软件分析120毫秒脉冲呈现后的100毫秒响应窗口，并使用最大响应峰值幅度来确定声学惊跳反应作为动物对惊吓脉冲反应的对照指数（图4A）。
其次，脉冲前脉冲试验（PPiS）相对于脉冲单独/惊吓试验（S）的反应性用于评估前脉冲抑制（PPI）（图4B）。使用以下公式计算每种声学预脉冲试验类型的预脉冲抑制量：百分比分数：＆nbsp;
％PPI = 100×（S-PPiS）/ S（图4B）
第三，为了测量前脉冲引发的反应性（PP），包括来自单独前脉冲试验的数据。
典型实验的结果应该显示随着前脉冲强度增加PPI水平增加，而变异性相对较低（图4C）。使用相同的菌株，性别和药物剂量时，特定药物对PPI的良好效果应该是可重复的。
惊愕反应数据通常表现出比PPI反应数据更多的可变性和可靠性。

图4.典型PPI实验的预期结果。：一种。在出现单脉冲和脉冲前脉冲试验后，软件输出100毫秒的响应窗口。箭头指示最大响应峰值幅度，其用于确定声学惊跳反应和最大响应时间作为动物对刺激的反应性的指标。 B.预脉冲 - 脉冲试验（PPiS）相对于单脉冲/惊吓试验（S）的反应性被用来评估前脉冲抑制（PPI）。 C.本研究所生产的具有BL6N背景的幼稚野生型小鼠显示了前脉冲抑制百分比（％PPI）。正如预期的那样，PPI水平随前脉冲强度增加（高于背景）而增加，并且变异性较低。

笔记

在我们研究所进行的所有PPI实验中，将动物饲养在每笼4-5只动物的集合笼中。尽管社会隔离可以改变大鼠的惊吓变量，但隔离对小鼠惊吓措施的影响尚未得到很好的表征。因此，在惊吓实验中使用已分离和单独饲养的小鼠并不理想。
在早上（从上午9点到下午2点）进行实验方案的所有阶段。
在小鼠中已经描述了惊恐反射和PPI的应变差异（Bullock等人，1997; Tarantino等人，2000; Willott等人，2003）。该协议在几个鼠标线上进行了测试。我们发现C57 / BL6N小鼠和我们研究所生产的BL6N背景的野生型动物之间有类似的结果，尽管每批小鼠的反应都有轻微的变化。
性别：雄性和雌性小鼠都已经用于惊吓反应性和PPI的方案中。如果在同一个实验日使用，为了避免对行为结果的影响，必须仔细地执行检测室的清洁过程。
年龄：年龄是听觉惊吓和PPI测量的重要变量。已经报道了包括C57BL / 6在内的许多近交系的年龄相关的听力损失，其可以改变惊吓反应性和PPI水平（Willott等人，1995）。此外，研究表明，与成年动物相比，早期青春期小鼠可以显示改变的惊吓反应性和PPI（Pietropaolo and Crusio，2009）。
不同的致精神病药物（ eg ，大麻素，苯丙胺等）可作为阳性对照（ ie ，PPI改变） br />

食谱

目前的协议不包含任何配方。如果使用任何致精神病药物或其他药物作为阳性对照，则应按照相关规程和制造商的指导原则进行准备。

致谢

我们感谢Delphine Gonzales，Nathalie Aubailly以及Neurocentre Magendie动物设施的所有人员对鼠标的关怀。我们也感谢克里斯托弗·史蒂文斯对本手稿的批判性阅读以及Susanna Pietropaolo博士在我们实验室中设立PPI时的建议。该行为协议最初用于布斯克茨 - 加西亚等人2017年。这项工作得到了INSERM（对GM），EU-FP7（PAINCAGE，HEALTH-603191对GM，FP7-PEOPLE- 2013-IEF-623638至AB-G。，欧洲研究委员会（Endofood，ERC-2010-StG-260515; CannaPreg，ERC-2014-PoC-640923，GM），Fondation pour la Recherche Medicale（DRM20101220445和DPP20151033974） GM），人类前沿科学计划（通用汽车公司），阿基坦大区（通用汽车公司），法国国家通用汽车公司-G，NeuroNutriSens ANR-13-BSV4-0006-02转GM和ORUPS ANR-16-CE37-0010转GM）。作者宣称他们没有利益冲突。

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