材料和试剂

铝箔（Cogepack，目录号：30060A）
培养皿60毫米（Eppendorf，目录号：0030701119）
无菌一次性手术刀（派拉蒙手表）
15 ml离心管（EUROCLONE，产品目录号：ET5015B）
50 ml离心管（EUROCLONE，目录号：ET5050B）
100μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352360）
24孔板（Eppendorf，目录号：0030722116）
T-25培养瓶（Eppendorf，目录号：0030710029）
无菌技巧
10μlPCR清洁/无菌（Eppendorf，目录号：022491202）
200μlPCR清洁/无菌（Eppendorf，目录号：022491296）
1,000μlPCR清洁/无菌（Eppendorf，目录号：0030077857）
高压灭菌指示带（Arintha Biotech，目录号：TS1950）
LS色谱柱（Miltenyi Biotec，产品目录号：130-042-401）
8孔室幻灯片（Corning，Falcon ，产品目录号：354118）
Coverslip（Menzel-Gläser）
pH纸
膜过滤器0.45μm（Merck，目录号：HAWP04700）
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（EUROCLONE，目录号：ECB4004L）
70％乙醇
免疫磁性分选（Miltenyi Biotec，目录号：130-097-049）
氯化铵 - 钾（ACK）裂解缓冲液（Lonza，目录号：10-548E）
抗成纤维细胞微珠，人类（Miltenyi Biotec，目录号：130-050-601）
正常山羊血清（NGS）（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
CD133微珠试剂盒 - 肿瘤组织，人（Miltenyi Biotec，目录号：130-100-857）
CD133，多克隆兔（Abcam，目录号：ab28364）
Notch1单克隆小鼠（Abcam，目录号：ab44986）
CXCR4单克隆小鼠（R＆amp; D Systems，目录号：MAB21651）
Oct4，多克隆兔（Abcam，目录号：ab19857）
巢蛋白，多克隆兔（Abcam，目录号：ab22035）
D2R，单克隆小鼠（Santa Cruz Biotechnologies，目录号：sc-5303）
SSTR2A，多克隆兔（Gramsch Laboratories，目录号：SS-800）
AlexaFluor 2 nd抗体（488和568：Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11008和A-11004）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
TrypLE-表达解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12605）
0.4％台盼蓝溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：145-0013）
牛血清白蛋白（BSA）热休克片段，pH 7，≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
EDTA（CARLO ERBA试剂，目录号：405497）
最低基本培养基（MEM）/ HAM'S F12（1：1，EUROCLONE，产品目录号：ECB2071L和ECB7502L）
胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270098）
L-谷氨酰胺（EUROCLONE，目录号：BE17-605E）
青霉素 - 链霉素（EUROCLONE，目录号：ECB3001D）
B27（50x，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
白血病抑制因子（LIF，Sigma-Aldrich，目录号：L5283）
bFGF（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-838）
EGF（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-825）
多聚甲醛（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：28908）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：71687）
甘氨酸（AppliChem，目录号：A3707）
Triton X-100（VWR，目录号：437002A）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：77067）
Mowiol（Merck，产品目录号：475904）
Tris缓冲液（pH 8.5）
磁性细胞分离器缓冲液（见食谱）
垂体腺瘤干细胞培养基（见食谱）
标准垂体腺瘤细胞培养基（见食谱）
甲醛溶液（见食谱）
100 mM甘氨酸（见食谱）
0.1％Triton X-100（见食谱）
Mowiol解决方案（参见食谱）

设备

外科剪刀和镊子（Exacta Optech，产品目录号：6.236 264和9.204 222）
高压灭菌器
移液器（10,200和1,000μl，Eppendorf，产品目录号：3123000020，3123000055和3123000063）
组织培养罩（Euroclone，BIOAIR，型号：TopSafe 1.8m Class II）
水浴（GFL，目录号：1083）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R和5427 R）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：3111）。
光学显微镜（Leica，型号：Leica DMIL HC TYPE 090-135.001）
连接到MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）的MidiMACS TM分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）
细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，型号：TC20 TM）

软件

统计软件（即，PRISM，GraPhad或类似软件）
ImageJ的

程序

制备
1. 将干净的剪刀和镊子包裹在铝箔中并高压灭菌。
2. 用紫外线对组织培养罩室消毒30分钟
3. 准备两个60毫米的菜肴，吸管3毫升冷无菌PBS的每盘，并将其放置在引擎盖。
收集垂体腺瘤组织
1. 未经选择的肿瘤样本来自在神经外科IRCCS-AOU San Martino-IST接受手术治疗的患者，在患者的知情同意和机构伦理委员会批准后获得。
2. 神经外科小组将一部分切除的肿瘤置于含有5ml PBS的15ml Falcon管中以送至实验室，立即进行原代培养物的建立。可用的样本通常非常小（同时考虑到病理学家对诊断的要求），但通常少于mm 3通常足以隔离推定的CSC。
  注意：样品必须收集并保持在4°C。
肿瘤组织解离
注意：所有步骤应在无菌条件下进行。
1. 用70％乙醇清洁输送管;将肿瘤组织转移到通风橱中的60毫米培养皿（图1）。
  
  图1.垂体腺瘤组织解离。代表性图片显示协议的不同步骤旨在从术后人垂体腺瘤样品获得原代培养物。从左至右：腺瘤样品最初用解剖刀切成小块，通过反复上下移液在单个细胞中机械解离，并通过100μm细胞过滤器过滤。右侧的最后一张图片表示新分离的垂体腺瘤细胞的形态（原始放大倍数10倍）。请注意，到达实验室的人体垂体腺瘤碎片的大小各不相同，通常很小。
2. 使用小钳子和解剖刀将组织分离成小片段（约2mm 3）：样品必须在无菌条件下机械分离以获得单细胞悬浮液（图1）。
  注意：机械解离通常足以在短时间内获得单细胞悬浮液（参见例如Florio等人，2003）。在使用大鼠和人垂体腺瘤的不同研究中分别报道了胰蛋白酶（Schettini等，1990）或胶原酶（Peverelli等，2017）的酶解离，但根据我们目前的经验，这不是必要的步骤当干细胞被分离时。
3. 通过放置在50毫升管顶部的PBS-预湿100μm细胞过滤器过滤细胞悬液（图1）。用1,000μl吸头粉碎任何残留的团块，并用1x PBS洗涤两次（三次，每次3ml）。
4. 在室温下（RT）将细胞悬浮液以300gxg离心5分钟，并用10ml移液管小心丢弃上清液。
5. 裂解红细胞（使用氯化铵 - 钾（ACK）裂解缓冲液，Lonza）;加入新鲜的PBS，并在室温（RT）下将细胞悬浮液以300×g离心5分钟，并弃去上清液。图1描述了肿瘤解离后获得的细胞悬液的代表性照片。
6. 为了从成纤维细胞中纯化垂体腺瘤细胞，加入80μl用于磁性细胞分离器的缓冲液（配方1），吸取几次直至细胞悬液均匀，然后加入20μl抗成纤维细胞微珠，吸取几次（图2A）并在室温下孵育30分钟。加入5ml用于磁性细胞分离器的新鲜缓冲液并在300gxg离心5分钟。同时，用70％乙醇清洗MACS分离器，并将其安置在生物罩下。将LS柱放入MACS分离器（Miltenyi Biotec，按照制造商的说明），并在顶部涂上2ml缓冲液（图2B）。一旦缓冲液完全流过，在柱下放置一个新的15ml试管，将细胞沉淀重悬于1ml缓冲液中，进行磁性分离，将悬浮液加入柱中并收集流出物。用1ml缓冲液（3次）冲洗柱子。
  
  图2.去除垂体腺瘤细胞悬液中的成纤维细胞污染。将80μl磁性细胞分离缓冲液加入到垂体腺瘤细胞中，吸取几次使细胞悬液均匀，然后加入20μl抗成纤维细胞微珠（A）。在室温下短暂温育后，加入5ml新鲜缓冲液，并在300×g下离心5分钟。同时，用70％乙醇清洗MACS分离器，并将其安置在生物罩下。将一个LS柱置于MACS分离器中并在顶部涂上2ml缓冲液。一旦缓冲液完全流过，在柱下放置一个新的15ml管，将细胞沉淀重新悬浮在1ml缓冲液中，并加入柱中进行磁选（B）。收集带有纯化细胞的污水。
7. 收集阴性部分（腺瘤细胞）在15毫升管中，加入新鲜的PBS并在300×g下离心5分钟。
  可选：为了恢复垂体腺瘤相关的成纤维细胞（与细胞珠粒结合的细胞部分），从分离器中取出柱子，放在新的15毫升试管中，加入3毫升缓冲液并用磁力标记的细胞冲洗柱子随柱子一起提供。
8. 用500μl垂体腺瘤干细胞培养基重悬细胞沉淀（在37℃水浴中预热）（方案2）。
9. 将每个细胞悬液（500μl）铺在MW24的一个孔中。
10. 培养细胞在37°C，在5％CO 2培养箱中。
11. 使用1毫升移液管，每2天仔细更换一次新鲜培养基。
通过选择性生长，将来自手术后人垂体腺瘤样品的分散细胞在干细胞允许培养基中电镀，促进了干细胞样细胞培养的富集。这些细胞确实显示出数周的细胞分裂能力，自我更新潜能（球形发生，图3A）和干细胞标志物表达（即，Sox2，CD133，CXCR4，巢蛋白，Oct4，Notch1，图4 ）。重要的是，这些人群继续在体外复制，尽管速度很低，几周。
使用免疫磁性分选（Miltenyi Biotec），在整个细胞群体上CD133表达细胞分选可以达到类似的结果，尽管该选择可能导致不表达CD133的干细胞样细胞亚群的丢失。此外，根据我们的经验，表达CD133的细胞在腺瘤中的百分比可能非常不稳定。
相反，在标准的垂体腺瘤细胞培养基（含有10％FBS，方案3）中，来自相同肿瘤的细胞代替导致发生未选择的培养物（图3C），主要含有非干细胞，在体外细胞存活。根据以前的研究，它估计只有一个细胞分裂体外。
注意：
1. 手术后人类垂体腺瘤样品的体积通常受到限制，因此在此过程后获得的活细胞数量可能会非常小。而且，考虑到低增殖率，每种培养物可行的检测数量是有限的。
2. 除了体外表征之外，操作上限定癌症干细胞的唯一参数是体内再现它们衍生的肿瘤的能力。就垂体腺瘤而言，小鼠中的细胞报道了对比结果，但最近在斑马鱼胚胎中报道了植入（Gaudenzi等，2017; Peverelli等，2017; Wurth等，2017）。
  
  图3.原代垂体腺瘤培养物的明场照片A.原代垂体腺瘤茎样培养物的代表性时间过程：手术后人垂体腺瘤样本经解离后获得单个细胞在干细胞允许的培养基中生长。大约1周后，干细胞样细胞开始复制，形成最终聚集在细胞球体中的大聚集体。 B和C.在干细胞允许培养基（B）和标准垂体腺瘤细胞培养基（C）中10天后，从相同NFPA组织中分离的原代垂体腺瘤细胞的代表性图片（em）。原始放大倍数为10倍。
  
  图4.分离的人体非功能性垂体腺瘤产生的垂体。：一种。在干细胞允许的培养基中培养的垂体腺瘤细胞的代表性明场照片：细胞以悬浮液形式生长为垂体。原始放大20倍。 B和C.显示干细胞标志物（CXCR4，CD133，左和Sox2，Notch1，右）表达的代表性免疫荧光图片。 D和E.干细胞标记物（Oct4和巢蛋白，红色）和调节性垂体受体（多巴胺受体2，D2R和生长抑素受体2，SSTR2，绿色）的共表达，表明选择和体外从原始肿瘤扩展干细胞样细胞。在所有的小组中，细胞核都用DAPI复染。
通过ICF染色鉴定垂体腺瘤干细胞
1. 在培养基中重悬分离的细胞，并转移到8孔腔室载玻片（约10,000个细胞/腔室）。
2. 48小时后，用PBS冲洗细胞5分钟，并在室温下用PBS中的4％多聚甲醛（方案4）固定15分钟。
3. 在室温下用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
4. 用100mM甘氨酸（配方5）在PBS中孵育细胞10分钟
5. 用0.1％Triton X-100（配方6）渗透细胞膜4分钟
6. 每次用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。
7. 与正常山羊血清（NGS，10％的PBS）孵育60分钟以减少下列抗体的非特异性结合。
8. 稀释2％NGS-PBS中的一抗，并在4°C孵育细胞过夜。
  注意：根据每个个体研究中所需的分析，可以使用不同的一抗。在我们最初的表征（见Wurth等2017）中，我们使用了以下抗体：Sox2，多克隆兔（Millipore）dil。 1：100; CD133，多克隆兔（Abcam）dil。 1：100; Notch1单克隆小鼠（Abcam）dil。 1：100; CXCR4单克隆小鼠（R＆amp; D Systems）dil。 1：250; Oct4，多克隆兔（Abcam）dil。 1：200;巢蛋白，多克隆兔（Abcam）dil。 1：100; D2R，单克隆小鼠（Santa Cruz Biotechnologies）dil。 1：100; SSTR2，多克隆兔（Gramsh Laboratories）dil。 1：100。图4描绘了垂体中标志物表达的实例。
9. 在室温下用PBS（200μl）洗涤细胞两次，每次5分钟。
注意：从这里开始，所有步骤都应该在黑暗中进行。
1. 用PBS中的第二抗体1：500（AlexaFluor）孵育细胞，在RT下孵育60分钟。
2. 在室温下将细胞在PBS（200μl）中洗涤两次，每次5分钟。
3. 在RT下添加DAPI 5分钟
4. Mowiol安装（配方7）。
5. 让幻灯片在黑暗中在水平位置平躺过夜。＆nbsp;
注：没有一抗的一个孔应作为阴性对照包含在所有实验中。
通过自我更新测定表征垂体腺瘤干细胞
1. 在培养一周后，将细胞收集在15ml试管中，在室温下将细胞悬浮液在300xg离心5分钟，弃去上清液。
2. 用1ml TrypLE-express解离试剂重悬沉淀，并在37°C孵育管5分钟。
3. 加入10毫升新鲜的PBS并在300×g下离心5分钟。
4. 通过添加1：2 0.4％台盼蓝溶液并使用自动化细胞计数器（参见设备）来确定活细胞数量。
5. 在垂体腺瘤干细胞培养基中的MW24的三个孔中种植1000个细胞/孔。 2分钟后，从每口井的4个随机区域拍摄照片。
6. 培养细胞在37°C，在5％CO 2培养箱中。
7. 每两天监测细胞的生长情况，分离的细胞会产生球状聚集体。
8. 为了证明长时间持续体外培养后自我更新的持久性，分离的细胞将产生二次球：解离一次球并重复步骤E1-E7。
所描述的程序和数据的代表性例子来说明所得结果的类型

数据分析

为了量化和监测人类原代垂体腺瘤干细胞自我更新的潜力（程序E），每100个细胞铺板产生的球体数目可以报告为球形成效率（SFE）（Wurth 等人，，2017）。增殖活性可以通过使用自动化细胞计数器（设备＃10）的细胞计数来评估，并使用统计软件（即em.PRISM或类似的）分析显着性。标记物表达的差异可以使用ImageJ软件进行量化。

食谱

磁性细胞分离缓冲液（储存在4-8°C，在室温下使用）
PBS pH 7.2
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
2 mM EDTA
垂体腺瘤干细胞培养基（用真空过滤器灭菌，在4°C储存）
最低基本培养基（MEM）/ HAM'S F12（1：1，EUROCLONE）补充：
1％的胎牛血清（FBS，Gibco）
2 mM L-谷氨酰胺（EUROCLONE）
1％青霉素 - 链霉素（EUROCLONE）
B27（50x，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM）
10ng / ml白血病抑制因子（LIF，Sigma-Aldrich）
20 ng / ml bFGF（Miltenyi Biotec）
20 ng / ml EGF（Miltenyi Biotec）
标准的垂体腺瘤细胞培养基（用真空过滤器灭菌，在4°C储存）
最低基本培养基（MEM）（EUROCLONE）补充：
10％胎牛血清（FBS，Gibco TM）
2 mM L-谷氨酰胺（EUROCLONE）
1％青霉素 - 链霉素（EUROCLONE）
甲醛溶液（在-20°C等分储存）
1. 通过在70℃下（在通风橱中）搅拌将16g多聚甲醛溶解于约80ml dH 2 O中。
2. 加几滴1N氢氧化钠解聚多聚甲醛
3. 将pH值调节到7.0左右，然后用pH试纸检查
4. 冷却到室温，并带来100毫升
5. 通过0.45μmMillipore过滤器过滤并与等量的双倍浓度缓冲液混合。
6. 分成方便的等分试样并在-20°C冷冻保存。
7. 解冻后丢弃
100 mM甘氨酸（储存在2-8°C）

加10毫升PBS中的75.07毫克甘氨酸
0.1％Triton X-100（2-8°C储存）

加10μlTriton X-100于10 ml PBS中
Mowiol溶液（在-20°C等分储存）
1. 将6g甘油（分析级）和2.4g Mowiol在6ml dH 2 O中混合。
2. 搅拌至少6小时
3. 加入12ml0.2M Tris缓冲液（pH8.5）并再搅拌6小时
4. 让混合物再放置2小时，然后在50°C孵育10分钟。
5. 旋转（5000 em x 15分钟）以除去未溶解的Mowiol
6. 在-20°C分装并冷冻上清液。

致谢

这项工作得到了意大利癌症研究协会（AIRC）的支持。作者没有利益冲突或竞争利益披露。

参考

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