材料和试剂

6或10厘米培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：353002或353003）
15ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352097）
磨砂玻璃（Superfrost Plus; Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
盖玻片（24 x 60毫米）（Fisher Scientific，目录号：12-545-M）
纸巾
玻璃巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A）
手套和实验室外套
感兴趣的人类细胞和适当的培养基
注意：该协议适用于贴壁细胞，可以对非贴壁培养物进行改变。
5'-溴脱氧尿苷（BrdU）（MP Biomedicals，目录号：100166）
注意：在双蒸水（1,000x）中制备10mM储备液;等分试样并储存在-20°C。
5'-溴脱氧胞苷（BrdC）（Sigma-Aldrich，目录号：B5002）
注意：在双蒸水（1,000x）中制备10mM储备液;等分试样并储存在-20°C。
Colcemid（Roche Diagnostics，目录号：10295892001;已稀释10μg/ ml） - 在4℃储存
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300）
胎牛血清（亚特兰大生物）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R5000）
注：在10mM Tris-HCl pH7.2中制备50mg / ml储备溶液。分装并储存在-20°C。
Hoechst 33258（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：H3569）
注意：在双蒸水中制成10μg/ ml溶液，并在4°C远离光线存放。
核酸外切酶III和缓冲液（Promega，目录号：M1811） - 在-20°C保存
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）-0.5mg / ml在水中的储液。
在4°C的黑暗中保存一年
ProLong Gold抗褪色试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P36934）
指甲油（莎莉汉森，透明哈德勒）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A452-4）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38C-212）
乙醇100％（Decon，目录号：2716），90％和70％
阻断剂（Roche Diagnostics，目录号：11096176001）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：SX0420-5）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：S318-500）
Tris-HCl pH 7.2（Sigma-Aldrich，CAS号：1185-53-1）
甲酰胺（Fisher Scientific，目录号：BP228;使用去离子进行杂交）
牛血清白蛋白（BSA）
Tween-20（Hoefer，CAS号：GR128-500）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，CAS号：6132-04-3）
氯化镁（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：AC41341-5000）
制造商：Acros Organics，目录号：413410025。
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0861）
低渗解决方案（请参阅食谱）
固定剂解决方案（请参阅食谱）
乙醇稀释（见食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
杂交解决方案（请参阅食谱）
杂交洗＃1（见食谱）
杂交洗＃2（见食谱）
肽核酸（PNA）探针（来自PNABio的定制探针）（见食谱）
氯化钠和柠檬酸钠缓冲液（SSC，见食谱）

设备

移液器（吉尔森）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
Coplin Jars（Scienceware，Sigma-Aldrich，目录号：S5641）
加热块（VWR）
水浴（Fisher Scientific，型号：Isotemp TM 210）
具有365-nm紫外线光谱的Stratalinker（Spectralinker XL-1000 1800 UV辐照器）（Spectronics Corporation，型号：XL-1000）
滑动塑料托盘 - 以适应Stratalinker
杂交室（详见文本）
轨道摇床
成像设备：
1. DeltaVision图像恢复显微镜系统（Applied Precision / GE Healthcare）
2. 奥林巴斯IX-70显微镜（奥林巴斯，型号：IX70）
3. 100x / 1.40 UPLSAPO物镜
4. CoolSnap QE CCD相机（Photometrics）

软件

SoftWoRx（由Applied Precision出售）
Metamorph 7.8（由Universal Imaging出售）
棱镜5（由GraphPad出售）

程序

掺入BrdU：C和中期染色体涂抹制剂
1. 收获前至少两天将细胞接种在6或10厘米的培养皿中，在收获时约为70％汇合。在一个10厘米的盘子里，种子约有一百万个细胞。
2. 然后通过与5'-溴脱氧尿苷（BrdU）和5'-溴脱氧胞苷（BrdC）温育标记细胞16-20小时。解冻1,000x BrdU和BrdC的等分试样并混合3：1以获得7.5mM BrdU + 2.5mM BrdC。以1：1,000的稀释度添加到细胞培养基中并孵育细胞过夜。
  注意：根据您的细胞生长较慢/较快以避免双重标记或未完全标记的细胞，调整BrdU：C标记的时间。您的目标是细胞在整个S期中整合BrdU和BrdC，并阻止它们在复制后退出有丝分裂。通常，将HeLa细胞与BrdU：C孵育14-16小时，然后加入秋水仙碱;以验证BrdU：C孵育的时间，可以使细胞与G1 / S上的胸苷同步，通过流式细胞术释放和监测有丝分裂退出。在胸腺嘧啶脱氧核苷释放15小时后退出有丝分裂的细胞应该用BrdU：C处理16-17小时，然后加入秋水仙碱，以确保只有在S期前开始标记的细胞被谷胱甘肽阻滞所捕获。 />
3. 添加colcemid到最终浓度0.1μg/ ml（1：100稀释10μg/ ml储液）以在收获前累积有丝分裂细胞约2小时。
  注意：避免将细胞留在秋水仙中超过3小时，因为长时间暴露于秋水仙碱会导致染色体形态非常紧凑。
4. 通过将上清液保存在15ml Falcon管中收获浮动细胞，用PBS洗涤培养皿一次，并将PBS洗涤物收集到相同的管中。胰蛋白酶消化5分钟，用含有胎牛血清的培养基封闭，并将其余的细胞收集在同一管中。
5. 在175μg×g下沉淀细胞5分钟。去除上清液，并重悬细胞在10毫升预热75毫米氯化钾溶液。轻轻地上下移动以重新悬浮颗粒。
6. 将细胞在KCl低渗溶液中37°C孵育30分钟（缓慢颠倒管每10分钟以保持细胞悬浮）。在将细胞沉淀之前，加入200μl固定溶液并通过缓慢颠倒管两次混合，有助于中期在离心过程中保持完整，因为低渗处理后细胞非常脆弱。将细胞在175μgxg下沉淀5分钟。
7. 吸出大部分上清液，留下约200μl的氯化钾通过轻拍管重新悬浮细胞或慢慢用P1000上下吹打。
8. 通过逐滴加入10ml新鲜制备的冰冷的MeOH-乙酸（3：1）固定剂溶液（在使用前30分钟制备，保持在-20℃），同时在涡旋混合器上连续涡旋该管来固定再悬浮的小球在最低速度设置（＃1）。
  注意：重要的是在加入固定剂之前重悬沉淀物，并且一次添加固定剂一滴，同时以至少第一次2ml的低速连续涡旋细胞。其余8毫升可以一次加入。
9. 将管倒置数次来混合。
10. 现在细胞可以保持在4°C几个月，远离光线储存。
11. 一旦准备好放下细胞，将试管在380×g 下旋转5分钟。根据每个试管中有多少个细胞吸出固定剂，留下约0.5-2毫升。
  彻底重新悬浮细胞
12. 如果您正在使用Superfrost Plus幻灯片，请直接转到步骤A13。如果使用常规载玻片，请在肥皂水中清洗并在使用前用Milli-Q水冲洗3次。将Milli-Q水在冰箱中放置一小时并在使用前保持干燥。
13. 通过将其放置在置于加热块上的热湿毛巾上，将您即将“降落”的载玻片加湿，直至其蒸发。您也可以通过在呼吸道上“呼吸”来达到此目的。
  注意：创建湿度条件，例如将湿纸巾放在相邻的90°C块上，继续释放蒸气，并且在紧邻滑片落下处加湿空气，或使用设定湿度的混合罩和温度，有助于提高价差的质量。
14. 使用玻璃巴斯德吸管，上下吸移并吸出细胞悬液。从约20厘米处将几滴细胞悬液倒入载玻片上的不同位置。
  您应该瞄准每次放置滑盖的所有部分。
  关于安全的注意事项：应使用手套和实验服来防止可能的飞溅。整个中期扩散程序可以在实验室化学通风橱中进行，以获得额外的保护。
15. 滴完后，立即将载玻片放置在42°C的块上，用湿纸巾覆盖块，约2-3分钟，细胞面朝上。
  注意：影响传播的因素有：湿度，温度，细胞滴在载玻片上的距离和干燥时间。
16. 在室温下远离光线的空气中干燥过夜。您可以将任何储存在新鲜固定剂中的隼管保存在4°C的温度下长达一年。
BrdU：C标记的新合成链的酶消化
1. 将滴落的载玻片插入Coplin广口瓶中，并在PBS（pH 7.0-7.5）中再水化5分钟（每个罐需要约35ml的溶液）。
2. 在37℃水浴中用0.5mg / ml RNA酶A（在PBS中，不含DNase）处理载玻片10分钟。
3. 在室温下轻微搅动下，用1μg/ ml Hoechst 33258（Sigma-Aldrich）稀释至2×SSC 15分钟，染色载玻片。
4. 将幻灯片放在浅塑料托盘中，并添加足够的2x SSC缓冲液以覆盖幻灯片。在Stratalinker 1800中，在室温下将载玻片暴露于365 nm紫外光下1800秒（30分钟;相当于5,400 J / m 2 2）。
5. 将BrdU：C标记的UV切口DNA链与80μl10U /μl核酸外切酶III（Promega）一起加入制造商提供的缓冲液中，稀释至1x（50mM Tris-HCl，5mM MgCl 2，，5mM DTT，pH 8.0）。将80μl溶液加到24×60盖玻片上，该盖玻片将与载玻片上的细胞的整个表面接触。让它粘附在载玻片上，然后将载玻片的一面朝上放置10分钟，远离光线。避免气泡。
6. 去除盖玻片并用新鲜溶液重复核酸外切酶III消化步骤10分钟。
7. 在PBS中清洗载玻片5分钟，并依次在70％，90％，100％乙醇系列中各自脱水2分钟。
8. 空气干燥的幻灯片和在室温下在黑暗中（可以放置过夜）。
荧光原位杂交
1. 将80μl杂交混合物放到盖玻片上，并用载玻片取出盖玻片，然后将载玻片放入杂交室（参见图1G-1I关于如何制备杂交室的说明以及这些步骤的视觉说明）。避免气泡。
  
  图1.在协议不同阶段的Cen-CO-FISH程序的代表性图像。：一种。收获细胞，低渗肿胀并固定过夜。样品可以在此阶段储存在4°C。然后将细胞滴在载玻片上以使中期分裂。在进入步骤B之前，可以在室温（RT）下在黑暗中储存载玻片。B.将载玻片在Coplin广口瓶中再次水合PBS 5分钟。 C.去除PBS并将RNA酶A溶液加入罐中，在37℃水浴中孵育10分钟。去除RNase溶液并在室温下用2x SSC与Hoechst孵育15分钟。 D.将幻灯片放入塑料试片并用足够的2x SSC覆盖。 E.将托盘放入带有365纳米紫外线灯的Stratalinker烤箱中并暴露30分钟（1,800秒）。 F.为每张载玻片准备80μl的核酸外切酶III溶液，并将溶液加入24×60盖玻片中，使其与载玻片的整个表面接触。 G.紧接紫外线照射后，如图所示用核酸外切酶III溶液提取盖玻片。翻转载玻片，调整盖玻片以确保它是中心的，液体分布良好并且没有气泡。室温孵育细胞10分钟，然后再次重复步骤F-G进行额外的核酸外切酶温育。用PBS洗涤并在乙醇系列中脱水。在室温下在黑暗中存放载玻片（过夜）。 H.将其中一种探针（1：1,000-1：5,000）置于杂交溶液中，在60°C下加热10分钟，然后将80μl加入到盖玻片上。按照所示的步骤F-G继续。 I.将载玻片放入杂交室并在室温孵育2小时。做一个房间，拿一个盒子，用纸巾填满，然后湿润，直到所有的毛巾潮湿。不要将幻灯片直接放在湿纸上面。使用移液器或其他形式的支撑物将盖玻片抬到湿纸上。将幻灯片的单元面朝上放置并远离光线将其关闭。 2小时后打开箱子，你会看到盖子上有少量凝结物。用杂交缓冲液＃1洗涤并用第二个反向补体探针重复步骤H（可以颠倒正向和反向补体探针之间的杂交顺序，它应该产生相同的结果）。在杂交缓冲液＃1和＃2中洗涤，包括DAPI步骤，脱水并风干至少1小时。在成像之前安装并密封。
2. 杂交室在黑暗中以1:1,000稀释度与正向PNA探针杂交（在使用前在60℃加热10分钟），然后在杂交室中避光2小时。
3. 冲洗1号洗涤30秒。
  保持幻灯片垂直排水10秒。
4. 与反向互补PNA探针以1:1,000稀释度（在使用前在60℃加热10分钟）在黑暗中杂交2小时。
  注意：颠倒探针的顺序不会影响信号的杂交或质量。
5. 在定轨摇床上用Wash＃1洗板1次15分钟2次
6. 在＃2号洗涤液中洗涤5分钟3次。第二次洗涤后，从0.5 mg / ml储液中加入1：500 DAPI。
7. 在70％，90％，100％乙醇系列中脱水3分钟
8. 空气干燥幻灯片约1小时。
9. 使用Prolong Gold嵌入介质（避免气泡）装载幻灯片并使用指甲油密封。幻灯片已准备好进行成像。
10. 幻灯片可在4°C或-20°C下保存1周，以保存更长时间。＆nbsp;

数据分析

图像采集和处理

使用安装在Olympus IX-70显微镜上的DeltaVision图像恢复显微镜系统（Applied Precision / GE Healthcare）对细胞进行成像，并装配100x / 1.40 UPLSAPO物镜和CoolSnap QE CCD相机（Photometrics）。
对每个实验的15个或更多中期扩展进行成像以产生统计学显着和代表性的结果。对细胞进行成像时，应注意选择染色体分离良好的最佳涂片（图2A），在核型稳定的二倍体细胞的情况下应选择约46条染色体。 DAPI的典型曝光时间为0.3秒，因为TRITC通道（红色探针）为0.1秒，而FITC（绿色探针）为0.5秒。
该图像是作为包含约15-30个0.2μm部分的z-叠层获取的。采用SoftWoRx（Applied Precision）对获取的图像进行解卷，并将其导出至Metamorph（Universal Imaging），以进行最大投影分析，如图2A和2B中的示例所示。

代表性图片和评分

按照概述的Cen-CO-FISH方案，如图2A所示，用特定的着丝粒标记物获得高质量的中期扩散。标记为红色的正向探针和标记为绿色的反向链探针不应重叠，而是彼此相邻，标记每个染色体的一个姐妹染色单体（图2B）。通过计算每个中期扩散中指示C-SCE的异常Cen-CO-FISH模式的数量进行量化（图2A，彩色框）。显示了正常（顶部面板，蓝绿色盒子;图2B）和指示C-SCE的异常Cen-CO-FISH模式的例子（底部面板，红色框;图2B）。在高染色体不稳定性（CIN）系或一些癌细胞系中，由着丝粒区外发生的融合事件可以发现少量异常模式，如通过分离两对着丝粒信号的DAPI的存在所指示的，以及应该从C-SCE的量化中排除（灰色框;图2C）。如先前所示（Giunta和Funabiki，2017），C-SCE的数量可表示为异常着丝点与每个中期相关的标记着丝粒对总数的比例，并使用Prism绘制在散点图中。

图2.使用Cen-CO-FISH方法检测人类着丝粒处的重组事件。：一种。使用针对CENP-B盒序列产生的正向（红色）和反向（绿色）探针，在存在于A中显示的中期扩散的所有染色体中的Cen-CO-FISH对HeLa细胞进行染色。单个通道允许目测识别异常Cen-CO-FISH染色模式，通常作为红色通道的“双点”和绿色通道的相同，如白色箭头所示。还显示了与DAPI合并的彩色组合图像。图2B中的框放大了。比例尺= 5微米。 B.来自图2A的左侧面板的放大的盒子，左侧面板显示用于正常Cen-CO-FISH染色模式（以深青色标记）的代表性图像，以及下面三个面板显示指示C-SCE的异常模式（标记为红色）。比例尺= 1μm。 C.由着丝粒序列外重组产生的异常染色模式（以灰色标记）的实例，因此排除了对着丝粒重组和C-SCE的定量。比例尺= 1μm。
Cen-CO-FISH是一种可靠，可重复和灵敏的标记技术，用于可视化重复的基因组区域。该技术依赖于两个关键步骤：位点的重复性以及将BrdU和BrdC并入新合成的链中。用于Cen-CO-FISH杂交的探针是荧光标记的PNA 17或18-mer。设计针对重复序列的探针可以扩增荧光强度。 Centromere alpha卫星重复序列从0.5-5 Mb到每个人类染色体共同的序列（Schueler等人，2001; Fukagawa，2004），产生一个可靠的Cen-CO-FISH信号用于可视化，获取使用传统的显微镜和功能分析。该技术依赖于新合成的链的标记，随后将被酶促消化，这表明该方法仅可用于循环细胞。然而，这也表示这种方法的优点，其中所产生的模式指示在单个先前细胞周期期间发生的重组事件。因此，Cen-CO-FISH提供了这些黑暗基因组区域的鸟瞰图，同时给出了特定的时间分辨率和序列方向信息来检查着丝粒重复的行为。先前的研究报道了应用Cen-CO-FISH技术来监测小鼠细胞中的着丝粒重组（Bailey等人，1996; Jaco等人，2008; Falconer等人，2010）表明该技术可以成功地应用于来自不同物种的组织培养细胞，使用专门设计的探针。

食谱

低渗解决方案
75毫摩尔KCl

每次使用前在37°C水浴中预热所需量
固定解决方案
3份甲醇
1份冰醋酸

每次都必须新鲜使用冰冷的
乙醇稀释

在双蒸水中70％和90％
阻止解决方案

将封闭剂（罗氏）溶解在马来酸缓冲液中制成10％的储备液 100毫摩尔马来酸
150 mM NaCl
用NaOH将pH调节至7.5，并保存在4°C
每次使用前都要剧烈摇动
杂交解决方案
10 mM Tris-HCl pH 7.2
70％甲酰胺
0.5％封闭剂（来自10％库存）
杂交洗＃1
10 mM Tris-HCl pH 7.2
70％甲酰胺（Sigma-Aldrich）
0.1％BSA（在加入甲酰胺前溶于双蒸水中）
杂交洗＃2
0.1M Tris-HCl pH 7.2
0.15M NaCl
0.1％Tween-20
对于DAPI清洗，使用0.5 mg / ml的原液添加1：500 DAPI。
肽核酸（PNA）探针（来自PNABio的定制探针）

对alpha卫星设置＃1 F3003 CENT-Cy3（Cy3-OO-AAACTAGACAGAAGCATT）
反向互补CENT-RC-488（Alexa488-O-AATGCTTCTGTCTAGTTT）
在CENP-B框中设置＃2：
F3002 CENP-B Cy3（ATTCGTTGGAAACGGGA）
反向补充CENP-B-RC-488（TCCCGTTTCCAACGAAT）
注意：
1. 基于制造商的说明将冻干的探针在双蒸水中稀释至50μM。分装并储存在-80°C以避免多次冻融。
2. 为了杂交，解冻并旋转探针，并以1：1,000-1：5,000的稀释度稀释到杂交溶液中（根据获得的信号进行调整）。使用前在60°C加热10分钟。
氯化钠和柠檬酸钠缓冲液（SSC; 20x）
NaCl（3M），柠檬酸钠（300mM）溶解在蒸馏水中
调整pH值到7.0并且高压灭菌器
工作稀释是2次

致谢

我要感谢洛克菲勒大学生物影像资源中心（BIRC）的H. Funabiki，F. Lottersberger，N. Bosco和T. DeLange，以及K. Thomas，A. North和T. Tong。我还要感谢Seneca Jason和A. Field在整个工作中的支持。这项工作得到了美国 - 意大利癌症基金会的奖学金和洛克菲勒科学奖学金的资助。该协议是根据Giunta和Funabiki（2017）和Celli等人发表的程序改编的。（2006）。
竞争利益声明：作者声明不存在利益冲突。

参考

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Bailey，S.M.，Williams，E.S。，Cornforth，M.N。和Goodwin，E.H。（2010）。染色体定位荧光原位杂交或链特异性FISH 方法Mol Biol 659：173-183。
Celli，G.B.，Denchi，E.L。和de Lange，T。（2006）。 Ku70刺激功能异常的端粒融合，但保护染色体末端免受同源重组。 Nat Cell Biol 8（8）：885-890。
Cheeseman，I. M.（2014）。动粒。冷泉Harb Perspect Biol 6（7）：a015826。
Choo，K. H. A.（1997）。着丝粒。牛津大学出版社，美国。
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Falconer，E.，Chavez，E.A.，Henderson，A.，Poon，S.S.，McKinney，S.，Brown，L.，Huntsman，D.G。和Lansdorp，P.M。（2010）。 DNA模板链序列鉴定姊妹染色单体。 Nature 463（7277）：93-97。
Fukagawa，T。（2004）。脊椎动物细胞中的着丝粒DNA，蛋白质和动粒组装。 Chromosome Res 12（6）：557-567。
Giunta，S.和Funabiki，H。（2017）。人类着丝粒DNA重复序列的完整性受CENP-A，CENP-C和CENP- T. 美国国家科学院院刊114（8）：1928-1933。
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Mitelman，F.，Mertens，F.和Johansson，B。（1997）。人类瘤形成中复发性染色体重排的断点图。 Nat Genet 15规格编号：417-474。
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Schueler，M.G.，Higgins，A.W.，Rudd，M.K。，Gustashaw，K.and Willard，H.F。（2001）。功能性人类着丝粒的基因组和基因定义。 Science 294（5540）：109-115。
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