材料和试剂

50ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
血清移液管，10毫升（Fisher Scientific，目录号：13-676-10J）
Lysing Matrix D管（2 ml）（MP Biomedicals，产品目录号：116913050）
锥形末端，金属刮刀（Fisher Scientific，目录号：14-374）
VacConnectors（QIAGEN，产品目录号：19407）
℃。 zofingiensis （SAG，目录号：211-14）
蛋白培养基（UTEX培养藻类，蛋白培养基）
楚氏培养基（UTEX藻类培养物，楚氏培养基）
液氮（LN 2）（各种）
湿冰（各种）
干冰（各种）
RNaseZap（250ml喷雾瓶）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9780）。
无RNase乙醇（乙醇）（100％和70％）（各种）
TRIzol（100ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15596026）
氯仿：异戊醇（24：1）（Sigma-Aldrich，目录号：C0549-1PT）
MaXtract高密度（100 x 15毫升）（QIAGEN，目录号：129065）
miRNeasy Mini Kit（50）（QIAGEN，目录号：217004），其中包括：
1. QIAGEN miRNeasy迷你色谱柱QIAGEN miRNeasy迷你色谱柱
2. 1.5和2毫升收集管
3. QIAGEN缓冲区RWT颜色：＃333333; font-family：＆amp; font-size：14px; font-style：normal; font-variant：normal ;字型重量：400;字母间距：正常;孤儿：2;文本对齐：左;文字修饰：无;文本缩进：0像素;文字变换：无; -webkit文本行程宽度： 0像素;空白：正常;字间距：0像素;” />
4. QIAGEN缓冲区RPE
5. 无RNase水
RNase-Free DNase Set（50个样品）（QIAGEN，目录号：79254），其中包括：
1. 无RNA酶的DNA酶I
2. QIAGEN缓冲区RDD
3M醋酸钠（NaOAc），pH = 8，无RNase（各种）
1M Tris盐酸（Tris-HCl），pH = 8，无RNase（各种）
5 M氯化钠（NaCl），无RNase（各种）
0.5M乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA），pH = 8，无RNase（各种）
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（各种）
20mg / ml蛋白酶K（Fisher Scientific，目录号：BP1700-100）
安捷伦RNA 6000纳米试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-1511）
裂解缓冲液（见食谱）

设备

冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
冷冻微型离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
洁净工作台
冰桶（康宁，目录编号：432122）
PIPETMAN Classic吸管（Gilson，型号：P20，目录号：F123600）
PIPETMAN Classic吸管（Gilson，型号：P200，目录号：F123601）
PIPETMAN经典吸管（Gilson，型号：P1000，目录号：F123602）
匀浆器（MP Biomedicals，型号：FastPrep-24 TM 5G）
匀浆器适配器（MP Biomedicals，型号：CoolPrep TM 24x2mL）
真空歧管（QIAGEN，型号：QIAvac 24 Plus）
加热块（VWR，目录号：75838-286）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000）
生物分析仪（安捷伦科技，型号：2100生物分析仪）

程序

细胞收集
该协议设计用于约2.5×10 8个细胞或更少（例如50毫升5×10 6细胞/孔的培养物） ml密度）的液体培养物C.zofingiensis 。例如见图1。

图1. C的液体培养物。 zofingiensis 。 C的液体培养物的例子。 zofingiensis （SAG 211-14）适合作为本协议的输入。在此，如前所述（Roth等人，2017），使细胞在补充有Chu's培养基（2ml / L，UTEX Culture Collection of Algae）的Proteose培养基（UTEX Culture Collection of Algae）中生长。培养物在25°C下在昼夜（16小时光照，8小时黑暗）条件下以100-150rpm振荡生长，光照强度为90-100μmol光子m 2 -2秒^{-1 。

将细胞培养物转移到50ml Falcon管中。

在4℃下以3,200×g（RCF）旋转5分钟。立即在离心机停止后，通过倾倒入废液容器快速移除上清液。

闪烁冷冻含有液体N 2下的细胞团的管。

可选：在进一步处理之前将样品存储在-80°C。}
制备
1. 使用洗涤剂清洗并在180°C下烘烤8小时，准备玻璃器皿和金属器具（包括刮铲）。
2. 使用RNaseZap或同等产品清洁工作台和移液器。
3. 根据配方准备新鲜的裂解缓冲液（参见配方）。
4. 预冷微量离心机，离心机和水桶至4°C。
5. 用碎冰块准备桶。
6. 用碎冰块准备桶。
7. 在干冰上冷藏100％乙醇。
8. 标签Lysing Matrix D管并放置在干冰上。＆nbsp;
细胞裂解和RNA纯化
1. 将冷冻样品管转移到干冰桶中。
2. 取一个干净，不含RNase的刮刀，上下推入管内，打碎细胞团。在这个过程中，管子应该保持在干冰上，以便细胞保持冷冻并防止RNA降解。
3. 吸取1毫升冷的100％乙醇到管中。
4. 用移液管将刮刀和EtOH转移到冷冻的Lysing Matrix D 2 ml试管中。
5. 在4℃下以2,700×g（RCF）旋转3分钟。澄清上清液。
6. 将破碎的干冰置于均质器托盘中，将管子输送至均化器，并以6.0米/秒运行60秒。重复60秒。
7. 添加1毫升新鲜制备的裂解缓冲液
8. 涡旋约30秒。
9. 在室温孵育3分钟。
10. 在20,800xg（RCF）旋转3分钟
11. 在室温下1,500 x g（RCF）旋转MaXtract管2分钟。
12. 添加10毫升TRIzol到MaXtract管
13. 用TRIzol将1毫升上清液转移到MaXtract管中。
14. 在室温孵育3分钟。
15. 加入2毫升氯仿：异戊醇，剧烈振荡30秒。
16. 在RT孵育5分钟。
17. 在室温下以1,500×g（RCF）离心5分钟。
18. 每个样品加入10毫升冷的100％乙醇到标记的50毫升锥形管中。
19. 使用EtOH将MaXtract管的水相（约6-7ml）倒入50ml锥形管中。
20. 将管子翻转数次混合，然后放在湿冰上。
21. 一次处理一个样本，而其他样本一直处于冻结状态：
  1. 打开真空。用新鲜的VacConnector将QIAGEN miRNeasy mini-column放置在真空腔体上。
  2. 使用10 ml血清移液管，将裂解液/ EtOH混合物加载到miRNeasy mini柱上，直到所有液体都通过膜。
  3. 关闭真空并将色谱柱放回其2毫升收集管中并置于冰上。＆nbsp;
22. 将色谱柱放回真空管，加入350μlQIAGEN缓冲液RWT。打开真空，直到所有缓冲液都通过色谱柱。
23. 将色谱柱返回收集管。
24. 在使用前，请准备QIAGEN RNase-free DNase Set中的新鲜DNase溶液。将足够的DNA酶（每个柱10μl）和QIAGEN缓冲液RDD（每个柱70μl）合并为所有样品。通过颠倒管子3-4次轻轻混合。
  注意：不要旋转DNase！
25. 在上一步中添加80μlDNase / RDD混合物到每个柱子。
26. 在30°C的加热块中孵育管15分钟
27. 将色谱柱放回真空歧管。
28. 每个色谱柱加入350μlQIAGEN缓冲液RWT
29. 打开真空，直到所有RWT缓冲液通过色谱柱。
30. 用QIAGEN缓冲液RPE缓冲液清洗两次柱子如下：
  1. 每个色谱柱添加500μlRPE
  2. 关闭盖子并轻轻旋转柱子以冲洗柱子的壁。
  3. 将色谱柱放回真空歧管。
  4. 打开真空，直到所有RPE缓冲液通过色谱柱。
  5. 重复。
31. 小心地从收集管中取出柱子以避免乙醇遗留，并将其放入新的2ml收集管中。
32. 在室温下以最大速度旋转1分钟（≥10,000 em x g（RCF））。
33. 将色谱柱放入一个新的1.5 ml收集管中。
34. 。将50μl不含RNase的dH 2 O直接加入离心柱膜。
35. 在室温下以最大速度旋转1分钟（≥1,000em x g（RCF））以洗脱RNA。
36. 用另外的50μl无RNA酶的dH 2 O（约90μl洗脱液）重复。
37. 加入270μlRNase-free dH sub 2 O。
38. 加入40μl3 M NaOAc（pH 8）。重新收集并倒置管混合。
39. 加入1,000μl冰冷的100％EtOH。回顾并翻转管混合。
40. 在-20°C孵育30分钟
41. 在4°C以最大速度（≥10,000 em x g （RCF））旋转30分钟。
42. 在不干扰颗粒的情况下，轻轻滗析上清液。
43. 用500μlRT 70％乙醇洗涤。
44. 不干扰沉淀，轻轻倒出上清液。用移液器清除残留的液体。
45. 在室温下空气干燥颗粒5-10分钟
46. 用60μlRNase-free dH 2 O重悬沉淀
质量控制
1. 用NanoDrop分光光度计测定吸光度。使用1μl的dH sub 2 O去空白NanoDrop。
2. 确定每个样品1μl的260,230和280nm的吸光度。通过生物分析仪上的微流体电泳测定RNA质量。
  1. 用9μl无RNase的水稀释每个样品1μl。
  2. 遵循制造商的协议，将1μl10倍稀释的RNA加载到RNA 6000纳米芯片的孔中，并使用真核生物总RNA程序进行测定。
    注意：或者，也可以使用Agilent Tape Station。

数据分析

查看NanoDrop分光光度计数据
1. A 260 / A 280比率应当约为2.1。如果比例为＆lt; 2.0或＆gt; 2.2。
2. A 260 / A 230比率应当约为2.1-2.4。如果比例为＆lt; 2.0。
查看生物分析仪报告
1. 18S和28S应该在〜1800 nt和〜3200 nt处有明显的峰值（图2）。
2. 由安捷伦软件计算的RIN值应该> 8.建议使用RIN <应该丢弃7个。
  注：由软件计算的RIN值可能低于来自其他物种的类似质量的RNA，这是由于在C.zofingiensis制剂中存在丰富的质体rRNA。＆nbsp;
  
  图2. C. zofingiensis RNA的电泳图。 C 的总RNA。 zofingiensis 由相应的方案制备，并使用Agilent 2100 BioAnalyzer与真核生物总RNA Pico芯片一起运行。

笔记

RNA对RNA酶造成的损伤非常敏感。仔细的实验室卫生对于降低这种风险至关重要。另外，细胞必须保持冷冻直至加入裂解缓冲液以防止RNA降解。准备许多RNA样品时，有些可能不符合数据分析部分中指定的质量控制标准。准备比实验要求更多的重复样本可能是明智的，以便在本协议结束时可以丢弃一些样本而不影响整体研究。

食谱

裂解缓冲液

给定的体积为10毫升。根据需要调整或调低
在使用前添加SDS和蛋白酶K

致谢

该协议已被改编自以前发表的论文（Roth等人，2017年）。这项工作得到了美国农业部国家食品与农业研究所（MSR）的农业与食品研究计划竞争性拨款号2013-67012-21272以及与美国能源部科学办公室的合作协议的支持生物和环境研究项目获奖DE-FC02-02ER63421。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Breuer，G.，Lamers，P. P.，Martens，D. E.，Draaisma，R.B。和Wijffels，R.H。（2012）。氮饥饿对9种微藻菌株中三酰甘油积累动态的影响。
Dönz，O.C. （1934年）。 Chlorella zofingiensis，eine neue Bodenalge。 Ber Schweiz Bot Ges 43：127-131。
Fučíková，K.和Lewis，L. A.（2012）。小球藻交集， Muriella 和 Bracteacoccus ：复活染色体属Chromochloris Kol et Chodat（Chlorophyceae，Chlorophyta）。 Fottea 12：83-93。
Liu，J.，Mao，X.，Zhou，W.和Guarnieri，M. T.（2016）。虾青素产油绿藻微藻同时生产三酰甘油和高价值类胡萝卜素小球藻zofingiensis 。 Bioresour Technol 214：319-327。
Mulders，K.J.M.，Janssen，J.H.，Martens，D.E.，Wijffels，R.H.和Lamers，P.P。（2014）。生物量浓度对缺氮小球藻中次生类胡萝卜素和三酰甘油（TAG）积累的影响zofingiensis。 Algal Res 6：8-16。
Roth，MS，Cokus，SJ，Gallaher，SD，Walter，A.，Lopez，D.，Erickson，E.，Endelman，B.，Westcott，D.，Larabell，CA，Merchant，SS，Pellegrini， Niyogi，KK（2017）。染色体水平的基因组组装和绿藻Chromochloris zofingiensis 的转录组照亮虾青素生产。美国国家科学院院刊114（21）：E4296-E4305。