材料和试剂

玻璃毛细管（3.5英寸长，Drummond Scientific，目录号：3-000-203-G / X）
一次性注射器（西格玛奥德里奇公司，产品目录号：Z230723）
Parafilm（Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
培养皿，尺寸60 x 15毫米（Corning，目录号：430166）
剃刀刀片（普莱诺，目录号：T5016）
巴斯德毛细吸管（150毫米，美因茨）
品牌移液器控制器微型经典（品牌，目录号：25900）
Q波段样品管（石英玻璃，1 mm i.d.，Bruker，目录号：ER 221TUB-Q10）
汉密尔顿注射器（汉密尔顿，目录号：80500）
培养皿，大小35 x 10毫米（Corning，目录号：430165）
毛细管密封剂（Cha-seal，DWK Life Sciences，Kimble，目录号：43510）
在MBS缓冲液中的阶段V / VI上的非洲爪蟾卵母细胞（Ecocyte Bioscience， ecocyte-us.com/products/xenopus-oocyte-delivery-service/ ）
（1x）（Ecocyte Bioscience）（88mM NaCl，1mM KCl，1mM MgSO 4，5mM HEPES，2.5mM NaHCO 3）的改良Barth's盐水（MBS）缓冲液，0.7mM CaCl 2）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
液氮
（马来酰亚胺基-2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基）（Sigma-Aldrich，目录号：253375）

设备

Flaming / Brown Micropipette Puller（Sutter Instrument，型号：P-97）
Nanoject II Auto-Nanoliter注射器（Drummond Scientific，目录号：3-000-205A）
带支持基地（Drummond Scientific，目录号：3-000-025-SB）的微操作器MM33（Drummond Scientific，目录号：3-000-024-R）
双目显微镜（ZEISS，型号：Stemi 2000-C，参加了AxiaCam ERc 5s相机（蔡司，型号：AxiaCam ERc 5s））
自制聚四氟乙烯支架
杜瓦液氮（KGW-Isotherm，目录号：1021）
-80°C冰箱

程序

注射器玻璃毛细管的制备
1. 玻璃毛细管所需的薄顶部由Flaming / Brown Micropipette拉拔器形成。程序参数选择如下：压力设置（P）= 500，加热= 558，拉= 100，速度（VEL）= 120和时间= 100毫秒（与200单位一致）。
2. Nanoliter注射器的确切位置可以通过显微操作器进行调整。 Nanoliter注射器的前端有一个螺丝夹和一个印章，后者的位置由控制计算机控制（见图1）。
  
  图1.显微注射设备的组装。：一种。控制计算机的放大视图; B.双目显微镜和显微注射设备; C. Nanoliter注射器顶部的放大视图。
3. 为避免印模与注射溶液之间产生气泡，使用一次性注射器将尖锐的玻璃毛细管充满矿物油。之后，将填充好的玻璃毛细管夹在邮票上，插入Nanoliter注射器的螺丝夹中。离开矿物油用纸巾擦掉。
4. 为了打开夹住的玻璃毛细管，将Parafilm拉伸到培养皿（尺寸60×15mm）的背面。一个小标记被压入培养皿边缘的Parafilm中。通过双目显微镜观察显微操纵器，玻璃毛细管缓慢移向皮氏培养皿上的标记。当玻璃毛细管开始接触石蜡膜时，通过同时降低显微操作器的毛细管并将培养皿从后者上移开，将其水平放置在石蜡膜上。用剃刀刀片仔细切割玻璃毛细管（约2.5毫米）的放下的前片。
5. 随后，将矿物油用打开的玻璃毛细管从Nanoliter注射器的印模上压出约2cm。这个流失可能需要15分钟。
6. 准备好的玻璃毛细管的顶部浸入一滴样品溶液（取决于要显微注射的爪蟾卵母细胞的数量，2-4微升）。使用Nanoliter注射器将样品溶液吸入毛细管中（见图2，制备的注射器玻璃毛细管）。＆nbsp;
  
  图2.准备好的非洲爪蟾卵母细胞和玻璃毛细管。：一种。在MBS缓冲液中用非洲爪蟾卵母细胞自制聚四氟乙烯支架的放大图。 B.使用自制的聚四氟乙烯支架，将制备好的注射器玻璃毛细管夹在Nanoliter注射器中。
显微注射非洲爪蟾卵母细胞
1. 在MBS缓冲液中的V / VI阶段的非洲爪蟾卵母细胞可以从Ecocyte Bioscience订购并在第二天冷却。将它们保存在18℃的MBS缓冲液中（室温设定为18℃），并在不迟于分娩当天用于样品制备。
2. 对于显微注射，用自制聚四氟乙烯（PTFE）支架上的巴斯德毛细管移液管制备6-7非洲爪蟾卵母细胞（通过PTFE研磨生产，尺寸为35×10mm，宽度为1mm和2毫米高的凹槽距离为4毫米）放入MBS缓冲液中，并用双目显微镜目视检查它们的状态（见图2）。在非洲爪蟾卵母细胞的黑色动物半球中具有凋亡初始迹象（例如松弛膜或轻度变色）的非洲爪蟾卵母细胞被拒绝（用于比较健康和受损＆lt; em＆gt;爪蟾卵母细胞见图3）。＆nbsp;
  
  图3.非洲爪蟾卵母细胞的显微照片A.健康非洲爪蟾卵母细胞没有细胞凋亡迹象; B.和C.在非洲爪蟾卵母细胞的黑色动物半球中的光变色作为凋亡的初始迹象用橙色圆圈标记。 C.以松弛膜和细胞变形形式的进展性细胞凋亡由红色椭圆标记。比例尺= 1毫米。
3. 非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜在黑暗的动物半球中，在分离线附近仔细刺破，分离线将动物半球与非洲爪蟾卵母细胞的轻质植物半球分开。穿透玻璃毛细管沿着分型线的方向移动，使得玻璃毛细管从斜上方指向分型线。样品溶液的注射（通常为50nl）在纳洛特注射器的这个位置进行，以便动物半球内的细胞核不会被注射（见图4）。
  
  图4.显微注射的工艺流程。：一种。非洲爪蟾卵母细胞的图解; B.对于显微注射，玻璃毛细管穿过动物半球中非常接近植物半球的非洲爪蟾卵母细胞，大约10°角，用红色箭头标记。 C.注射期间玻璃毛细管的位置（以深蓝色显示）。
4. 将玻璃毛细管小心拔出即可取出。受伤的爪蟾卵母细胞被丢弃，而成功注射的非洲爪蟾卵母细胞用MBS缓冲液仔细洗涤。
收集在EPR样品管中
1. 在显微注射时，三个（用于约34GHz的脉冲Q波段EPR测量）或五个（用于约9.5GHz的X波段连续波[cw] EPR测量）非洲爪蟾卵母细胞仔细转移到Q波段EPR样品管。为此，在样品管的一端用移液器控制器构建轻微的负压，该样品管用MBS缓冲液润湿。
2. 最初收集少量MBS缓冲液，然后收集非洲爪蟾卵母细胞，并再次收集少量MBS缓冲液。应注意确保样品管内非洲爪蟾卵母细胞之间没有空间。此外，必须通过使用双目显微镜进行肉眼观察来确保非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜未被收集损坏，并且样品管中没有气泡。否则，该样本不可用。在18℃，在非洲爪蟾卵母细胞所需的孵育时间后，必须再次进行这种视觉检查。
3. 孵育时间必须根据显微注射时非洲爪蟾卵母细胞的形态学稳定性和非还原性非洲爪蟾还原环境中顺磁性自旋标记的稳定性来选择，卵母细胞。两者都是在最终的单元格内EPR实验之前确定的（请参阅数据分析）。
4. 在18℃温育时间之后，使用Hamilton注射器移除样品管中的上清液MBS缓冲液，使得MBS缓冲液刚好覆盖外部非洲爪蟾卵母细胞的边缘，最大值距离非洲爪蟾卵母细胞边缘1-2毫米的距离（完成准备的样品管参见图5）。
  
  图5.准备Q波段样品管，其中有三个非洲爪蟾卵母细胞在冲击冷冻前用于MBS缓冲液中脉冲Q波段EPR测量
5. 对于脉冲Q波段EPR测量（约34 GHz），样品随后在液氮中冷冻并在-80°C冷冻箱中储存，直至测量而不解冻。相反，对于20°C下的X波段cw-EPR测量（〜9.5 GHz），样品管在顶部用毛细管密封剂密封，以确保管内固定样品位置。此外，X-band cw-EPR测量必须在样品制备后立即进行，因为细胞内顺磁性自旋标记的稳定性和微注射非洲爪蟾卵母细胞的形态稳定性可能受时间限制20°C（见数据分析）。

数据分析

研究注射样品的细胞毒性效应：必须在显微注射顺磁性样品溶液时检查非洲爪蟾卵母细胞的形态学稳定性，以确保在选择的温育时间之后样品中的所有细胞仍然完整。正如Groß等人所建议的，这可以在数小时内进行形态学研究。（Qi等人，2014; Wojciechowski等人，2015）。
研究顺磁性自旋标记的稳定性：非洲爪蟾卵母细胞还原环境中自旋标记的稳定性通过测量标记的大分子的X带cw-EPR信号来测试，所述标记的大分子微量注射到非洲爪蟾卵母细胞在18°C。信号强度的衰减对应于在所施加的条件下顺磁性自旋标记的减少。 18℃下，爪蟾卵母细胞中不同半衰期的信号衰减（Qi等人，2014; Karthikeyan等人，。，2017）。
对于具有足够稳定性的自旋标记，通常选择在18℃约60分钟的孵育时间（Qi等人，2014; Wojciechowski等人，2015）。使用3-马来酰亚胺基-PROXYL（3-马来酰亚胺-2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基氧基）自旋标记，18℃下的典型温育时间在15分钟的范围内（Cattani等人，，2017）。
内源性顺磁性物种：非洲爪蟾卵母细胞含有内源性顺磁性Mn（II）物质，这些物质也在EPR谱中表示（Qi等人，2014）。因此，测量未处理的非洲爪蟾卵母细胞的背景校正（Qi等人，2014; Cattani等人，2017）。
通过扩散进行注射体积的空间扩张：为了确定在显微注射时爪蟾卵母细胞内靶分子的平移扩散的影响，局部浓度可以通过双电子电子共振来确定（ DEER）测量值（Jeschke et al。，2006; Cattani em et al。，2017）。

笔记

玻璃毛细管中的可压缩气囊会导致错误的注射量和注射速度。
用剃刀刀片打开玻璃毛细管时，切割太多或太少的玻璃毛细管都很重要。如果太多被切断，玻璃毛细管的直径将太大而不能显微注射，而不会广泛地破坏非洲爪蟾卵母细胞。如果切断太少，类毛细管的稳定性将不足以穿透非洲爪蟾卵母细胞。
确保非洲爪蟾卵母细胞总是被MBS缓冲溶液覆盖。
对于快速连续的显微注射，将聚合四氟乙烯支架中的非洲爪蟾卵母细胞以相同的方式对齐，方法是用纳升注射器中夹住的玻璃毛细管仔细转动它们。
在培养皿（尺寸为35×10mm）上的Parafilm条带促进了非洲爪蟾卵母细胞在Q带样品管中的装载，从而在培养皿中间形成了一个升高点（参见图6）。将非洲爪蟾卵母细胞用巴斯德移液管加入一滴MBS缓冲液中，直接在模拟出石蜡膜的海拔旁边的陪替氏培养皿中。通过用Q波段样品管轻轻推动非洲爪蟾卵母细胞抵抗Parafilm提升，可以使非洲爪蟾卵母细胞进入适当位置收集非洲爪蟾卵母细胞进入样品管，它们之间没有空间。

图6.将非洲爪蟾卵母细胞轻松收集到Q带样品管中的装配A.非洲爪蟾卵母细胞置于通过移液器控制器可以很容易地将一个MBS缓冲液滴在培养皿旁边的石油培养皿旁边，通过Parafilm制成的标高可以很容易地收集在Q波段样品管中。 B.非洲爪蟾卵母细胞定位和收集的放大视图。

致谢

所描述的方案已由Malte Drescher教授研究小组的不同成员开发和改进，并基于AndreasGroß博士的先前方案（Qi等人，2014; Wojciechowski，等），以及Julia Cattani博士（Cattani等人，2017）。我们感谢Juliane Stehle和Anna Bieber提供了图6中的图片。我们非常感谢Deutsche Forschungsgemeinschaft在SPP 1601优先计划中提供的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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