材料和试剂

放射性标记的目标DNA片段
14.3 Mβ-巯基乙醇
500mM EDTA
苯酚
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：BO126）
二甲苯Cyanol（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
甲酰胺去离子（Panreac Applichem，目录号：A2156）
Cholorophorm
哌啶，纯度等级：pro分析（p.a。）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：411027）
乙醇（纯度等级：分析）（p.a.）
X光片
糖原（1μg/μl）（例如，Roche，目录号：10901393001）
NaOAc（300mM pH = 5.5）可选用于程序B（引物延伸分析）
非无线标记的目标DNA片段
5' - <32> P标记的脱氧寡核苷酸引物
NaOH（10mM）
Tris
MgSO 4 4 /
DTT
DNA聚合酶I的Klenow片段（例如Biolabs，目录号：MO210S）
NH 4 OAc
使用370mM KMnO 4储备溶液（用H 2 O进行1:1的稀释用于反应）（参见配方）
苯酚/氯仿（见配方）
中和解决方案（参见配方）
dNTP mix（参见配方）
停止混合（参见配方）
电泳加载缓冲液（参见配方）

设备

台式离心机
涡流振动器
孵化器
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统
真空浓缩器

程序

通过哌啶催化的链断裂分析具有3'-或5'-末端标记的DNA的足迹。
1. 将4μl的160mM KMnO 4溶液加入放射性标记的目的DNA片段（40ng; 5,000至10,000cpm）（在存在或不存在结合配偶体的情况下），总体积为40μl。
2. 在30°C孵育样品2分钟; 轻轻混匀。
3. 通过加入4.8μlβ-巯基乙醇停止反应; 再次混合
4. 将样品放在冰上。
5. 加入5.3μl500mM EDTA
6. 用100μl苯酚/氯仿提取样品三次，每次用涡旋振荡振荡1分钟
7. 离心样品（5分钟，3,000rpm），并取水层
8. 用2.5倍体积的无水乙醇（-20℃）沉淀样品
9. 离心管（10分钟，10,000rpm，4℃）
10. 将湿乙醇沉淀溶于70μl10％（v/v）哌啶中
11. 在90℃孵育样品30分钟。
12. 在真空浓缩器中冻干样品直至干燥
13. 加入30μl蒸馏水，并再次冻干
14. 重复步骤9.
15. 将最终的颗粒溶解在50μl蒸馏水中
16. 加入4μl300mM NaOAc（pH5.5）
17. 加入1μl糖原（1μg/μl）以帮助沉淀
18. 用2.5倍体积的无水乙醇（-20℃）沉淀样品
19. 用150μl70％乙醇洗涤沉淀。
20. 在真空浓缩器中短暂干燥样品以除去过量的乙醇并溶解在5μl电泳上样缓冲液中
21. 分别在10％或15％变性聚丙烯酰胺凝胶上，取决于DNA片段的大小
22. 通过放射自显影（过夜X射线曝光）显现放射性带
通过引物延伸分析用非标记DNA的足迹
1. 在存在或不存在结合配偶体的情况下，将4μl160mM KMnO 4溶液加入到40μl非标记的DNA片段（〜100ng）中。
2. 按照程序A的步骤2至8.
3. 将沉淀溶于35μl蒸馏水中。
4. 加入1μl与目的下游序列互补的适当的15至20个寡核苷酸5' - 寡核苷酸32-标记的脱氧寡核苷酸引物（〜5×10 5，/sup> cpm）。为了方便分辨，引物应该不超过感兴趣区域下游的50至80个核苷酸结合
5. 加入4μl10mM NaOH
6. 在80℃下孵育2分钟。
7. 将样品在冰上5分钟。
8. 加入4.5μl中和溶液并混合样品
9. 在68℃孵育3分钟进行杂交
10. 将样品置于冰上，加入5μl所有四种dNTP（各5mM），1单位DNA聚合酶I的Klenow片段，并轻轻混合。
11. 延伸反应在50℃下进行10分钟
12. 将样品置于冰上，通过加入17μl终止混合物终止反应
13. 样品用2.5体积的乙醇（-20℃）沉淀
14. 用150μl70％乙醇洗涤沉淀。
15. 在真空浓缩器中短暂干燥样品以除去过量的乙醇并溶解在5μl电泳上样缓冲液中
16. 分别在10％或15％变性聚丙烯酰胺凝胶上，取决于预期的cDNA片段的大小。
17. 通过放射自显影（过夜X射线曝光）显现放射性带

食谱

wmnO 4储备溶液（370mM） KMnO 4（MW = 158.04）的溶解度极限为〜60g/L（对应于0.37M）。
通过将12g KMnO 4加入220ml蒸馏水中制备200ml储备溶液。将溶液煮沸直到其达到200ml的最终体积。该储备溶液可以在黑暗的瓶子中保存几个月。
苯酚/氯仿
使用苯酚和氯仿的1:1混合物（v/v），纯度等级：前分析（p.a.）用于提取。苯酚用1M Tris-HCl（pH7.9）饱和，然后向苯酚中加入0.1％（终浓度）8-羟基喹啉以避免氧化。
中和溶液
0.5M Tris-HCl（pH7.2） 0.1M MgSO 4 2 mM DTT（步骤B可选）
dNTP mix
5mM，dATP，dCTP，dGTP，dTTP（对于方法B可选）
停止混合
4 M NH 4 OAc
20 mM EDTA（对于步骤B可选）
电泳加载缓冲液
0.1％（w/v）溴酚蓝
0.1％二甲苯蓝 95％甲酰胺去离子
25mM EDTA（pH8.0）

致谢

我们喜欢感谢实验室的人们进行有益的讨论。该实验室的工作由Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）SPP 1258 [Wa455/13-2]和[PU 435/1-1]资助。

参考文献

Hayatsu，H.and Ukita，T。（1967）。高锰酸盐氧化对核酸中嘧啶的选择性降解。生物化学 Res Commun 29（4）：556-561。
Stratmann，T.，Pul，U.，Wurm，R.，Wagner，R.and Schnetz，K。（2012）。 RcsB-BglJ激活大肠杆菌 leuO基因，编码一个H- NS拮抗剂和毒力决定子的多效调节剂。 Mol Microbiol 83（6）：1109-1123。
Sasse-Dwight，S.and Gralla，J.D。（1989）。 KMnO 作为lac启动子DNA的探针熔解和机制 > in vivo 。 J Biol Chem 264（14）：8074-8081。