材料和试剂

玻璃载玻片（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-550-15）
封面纸（Fisher Scientific，Fisherbrand，产品目录号：12-545M）
小培养皿（Corning，Falcon ，目录号：351029）
大培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5981-100EA）
制造商：Excel Scientific，产品目录号：D-902。
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
接种环（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：22-363-597）
无菌木制牙签（任何品牌，121°C高压灭菌器中15分钟，盖在铝箔容器中）
铜绿假单胞菌菌株MPAO1（华盛顿州西雅图市华盛顿大学的Manoil实验室博士）或具有功能性抽动动力的其他纤毛菌株（或细菌菌种）。（MPAO1是野生型铜绿假单胞菌菌株，可从华盛顿州西雅图的华盛顿大学获得。 http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm ）
（例如，人类泪液）
测试物质
去离子水
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Fisher Chemical，目录号：M63-500）
结冷胶（Alfa Aesar，目录号：J63423）
胰蛋白胨（BD，Bacto TM TM，目录号：211705）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：S271-3）
酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：288620）
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）粉末（BD，Difco TM，目录号：236950）
抽动媒介（见食谱）
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板（见食谱）

设备

镊子（Dumont，DumoxelNº5，Fine Science Tools，目录号：11252-30）
本生燃烧器
3. 60°C烤箱（Boekel Scientific，型号：133000）
无菌生物安全柜（NUAIRE，型号：NU-425-600）
具有高NA物镜和数码相机的复合显微镜（≥1.2）。我们的研究使用：
1. 尼康Ti-E倒置式宽视野荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse Ti-E）
2. Uno-combined控制器（Okolab）和台式培养箱保持样品在37°C（Okolab，型号：H301-Nikon-TI-S-ER）
3. CFI Plan Apo Lambda 60x NA 1.4油品（Nikon Instrument，型号：CFI Plan Apochromat Lambda（λ）系列）
4. DS-Qi2单色CMOS相机（尼康仪器，型号：DS-Qi2）＆nbsp;
电脑。 MacPro5.1（2012），2x 2.4 GHz 6核Intel Zeon，64 GB 1333 MHz DDR 3 ECC

软件

ImageJ（版本1.51n）或FIJI（ http://fiji.sc/ ）
R编译器（版本x64 3.4.1）（ https://www.r-project.org/ ）

程序

幻灯片的制备
1. 用镊子（也可以消毒）将本品放在本生灯上灭菌
2. 将幻灯片（最多4个）放入大培养皿中。
3. 迅速将1 ml抽搐介质（保持在〜60°C）倒在每张载玻片的一个表面上，并使其均匀铺展（通过重力）。
  介质的近似厚度应为1.5-2毫米。
4. 将载玻片放入生物安全柜（BSL2）中冷却并晾干（20分钟）。然后，用干燥的Kimwipe轻轻地清洁载玻片的下侧以除去任何残留的抽动介质。
5. 在载玻片的背面画一个圆圈（〜5mm直径）以标记要吸附待测物质的位置（见图1）。每张幻灯片最多可绘制3个圆圈。
6. 将5μl要测试的物质滴到覆盖在圆上的介质上（图1）。确保不要触摸介质。
  5μl体积通常覆盖约5 mm的圆圈
7. 在生物安全柜（BSL2）中干燥载玻片（15分钟）。
8. 如果需要更多样品，可以重复步骤A6和A7。
图1.抽搐试验的实验设置和图像。：一种。示意图显示了实验装置。将抽动介质（〜60°C）倒入载玻片上，使其在生物安全柜（BSL2）中冷却并干燥20分钟。加入待测物质后，在接种细菌前，将载玻片在生物安全柜中再次干燥15分钟。然后将盖玻片置于待测试的接种物质上，并将该玻片在潮湿的环境中在37℃温育4小时。 B.带有盖玻片的接种载玻片的实例显示三个圆圈，在每个被测物质的重复内。 C.含有4个带盖玻片的接种载玻片（比如不同物质或不同浓度的相同物质的对照载玻片与三个载玻片）的大培养皿的实例。包括两张湿纸巾以防止在4小时孵育期间抽搐介质的干燥。尽管没有显示，培养皿在孵化过程中盖上盖子以保持湿度。
接种抽搐介质
1. 从TSA平板上的过夜生长中，用接种环刮一些菌落并在平板上混合。这有助于确保所有接种源自细菌的均质混合物，而不是单个克隆，从而减少由于表型变异导致的可能的运动性差异。但是，如果适合研究目标，可以测试单个菌落。
2. 。将极少量的细菌（直径约0.5毫米）转移到无菌牙签的尖端。
3. 使用牙签将细菌轻轻涂抹在圆形中心的玻片上，而不刺穿抽搐介质。需要接种一个中心点。
4. 使用无菌镊子在培养基和接种点上放置盖玻片（不要按压到接种点）（图1）。
5. 用去离子水湿卷纸巾。放入带有载玻片的大培养皿以保持湿润（图1）。覆盖培养皿。
6. 在37°C孵育4小时
成像
在步骤B6中温育后，使用具有微分干涉的60x / 1.4NA油浸透镜，在37℃下在接种点边缘（10秒间隔持续5分钟）获取细菌的延时电影对比度（DIC）。

数据分析

使用ImageJ对DIC细菌颤动动力的电影进行计算分析。用于我们分析的代码已经在Github存储库中提供以供参考（Smith，2017）。具体而言，分析使视野和帧之间的对比度标准化。这允许间接定量细菌运动性作为随时间的光调制程度，其中高运动性的区域将调节光比区域低运动性更多。通过在处理过的电影中随时间变化的强度的标准偏差创建相对细菌运动的地图（参见示例，图2）。然后通过将标准偏差的分布作为缺口盒图（见图3）比较各样品中的总动力，其中如果缺口不重叠，则认为两种分布显着不同。

图2.从原始影片创建动态贴图使用带通滤波器处理原始影片，以规范视野范围内的对比度，并增强特定于个别细菌的对比度。然后通过对处理后的电影进行标准偏差Z投影来生成运动图。比例尺= 50微米。

图3.比较样本之间的运动分布样本之间的运动分布可以使用缺口盒形图进行比较，其中缺口表示每个分布的95％置信区间。

在FIJI或ImageJ中打开原始原始影片。
使用二维中值滤波器（过程→滤波器→中值）去除电影中的热像素和其他单像素异常值（对于我们的数据，半径为2.0像素的中值滤波器效果最好）。
使用2D带通滤波器（过程→FFT→带通滤波器）来规范任何渐晕和/或其他低空间频率背景不均匀性，以及消除高空间频率噪声（对于我们的数据，我们使用较低的40的界限和2的上界）。这些数字需要根据样品和显微镜进行调整，下限主要受细菌大小的影响（对于较小的细菌，例如金黄色葡萄球菌可能需要较小的细菌下界），并且上限主要受数字分辨率/光学分辨率的比率影响，其中比率越大（其中相机分辨率远大于光学分辨率）比例越大上限。带通的目的是消除任何与个别细菌无关的空间频率，从而大大抑制任何卷积调制。
创建电影的标准偏差Z投影（图像→叠加→Z项目），以创建整个视野的细菌运动强度图。
生成标准偏差图的直方图（分析→直方图），以获得视野内细菌运动的分布。
由于动力分布可能不正常，而是严重偏斜，因此可以使用缺口箱形图比较分布（图3）。因为缺口允许快速查看所有可能的成对样本组合（Krzywinski和Altman，2014），因此缺口盒图非常有用，因为缺口可以快速显示样本中所有可能的成对组合。

笔记

对于每种测试物质，我们通常在一张幻灯片上使用三次重复。每个实验还包括具有三次重复的抽动运动阳性对照载玻片。我们没有观察到重复接种之间动力的巨大差异;然而，如果殖民地太大，殖民地边缘可能难以辨别。
来自相机的噪音和光源随时间的变化也会导致电影中强度的小调制。因此，需要选择标准偏差的最小截止值，以完全排除背景而不去除细菌调节。在我们的设置中，我们发现5.0的截断效果最好。
为了使动力映射更加清晰，我们使用了ImageJ提供的'物理'LUT（图像→查找表→物理），它给出了一个谱图热图，使局部运动的差异更加明显。为了增加清晰度，我们将0强度的像素设置为黑色（图像→颜色→编辑LUT）。
为了使用Github存储库中提供的脚本，首先，请转到提供的链接，然后单击“克隆或下载”并将存储库作为zip文件下载。解压缩文件，然后按以下顺序运行文件：
1. 将名为“Measure stack standard deviation.ijm”的文件拖放到FIJI / ImageJ中。这会将代码加载到宏IDE中。然后在IDE窗口中按“运行”。这将拉起一个用户界面，该用户界面将要求包含要分析的所有图像的目录，然后提示您输入保存结果的目录。随后会提示您输入数据的较低和较高标准偏差截止值。代码将自动处理数据，并将每个样本的直方图输出到名为“Sample histogram.csv”的文件中的输出目录中。注意：当前的代码只能处理* .nd2文件;这个扩展可以在宏的第3行进行更改。
2. 在文本编辑器中打开名为“Boxplot code - R.r”的文件，并将第8行上的目录更改为包含（a）中的直方图的目录。然后将代码复制并粘贴到R编译器中，它会自动从直方图创建缺口箱形图。
  注意：如果最小和/或最大标准偏差截止值已经从宏中的默认值改变，那么它们将不得不在R代码的第5行中相应地更新。如果您忘记了该范围，则二进制值将被存储在名为“Histogram bins.csv”的文件中的输出目录中。＆nbsp;

食谱

抽动媒介
1. 在〜80ml蒸馏水中溶解0.1g MgSO 4·7H 2 O，0.8g结冷胶，0.4g胰蛋白胨，0.2g酵母提取物和0.2g NaCl， > 2 O并摇动，直至溶质溶解
2. 用H 2 O
  调整溶液的最终体积至100ml
3. 在液体循环中通过高压灭菌进行灭菌。将介质保持在60°C直至倾倒以防止凝固
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板

将40克TSA粉末悬浮在1升纯化水中。
在液体循环中彻底混合并通过高压灭菌进行灭菌
冷却至约50°C，将约20毫升倒入水平表面上的每个小培养皿中。
用盖子覆盖培养皿并在室温下固化（〜2小时或直至固体和干燥）

致谢

该协议最初在2017年的PLoS Pathogens的Li等人中介绍。这项工作得到了国立卫生研究院的支持; EY011221（SMJF），EY024060（SMJF）和EY003176。作者没有利益冲突要申报。 P上。铜绿假单胞菌菌株MPAO1获自华盛顿大学（Dr.Monoil实验室），西雅图，华盛顿州，之前曾用于产生磷。由NIH P30 DK089507资助的绿脓杆菌PAO1转座子突变体文库。

参考

Alarcon，I.，Evans，D.J。和Fleiszig，S.M。（2009）。颤动动力在<铜绿假单胞菌退出角膜和移位角膜上皮细胞。 Invest Ophthalmol Vis Sci 50（5）：2237-2244。
Burrows，L. L.（2005）。大规模回缩武器 Mol Microbiol 57（4））：878-888。
Krzywinski，M.和Altman，N。（2014）。用箱形图可视化样本 Nat Methods 11（ 2）：119-120。
Li，J.，Metruccio，M.M.E.，Smith，B.E.，Evans，D.J。和Fleiszig，S.M.J.（2017）。粘膜液糖蛋白DMBT1可抑制机会性病原体的抽动动力和毒力<铜绿假单胞菌。 PLoS Pathog 13（5）：e1006392。
Mattick，J. S.（2002）。 IV型菌毛和抽动动力 Annu Rev Microbiol 56：289-314。
Semmler，A.B.，Whitchurch，C.B。和Mattick，J.S。（1999）。重新检查绿脓杆菌中的抽动动力。 > 微生物学 145（Pt 10）：2863-2873。
Smith，B.E。（2017）。细菌抽动，定量。 Github存储库。 https://github.com/Llamero/Bacterial-Twitching-Quantification。 >
Whitchurch，CB，Leech，AJ，Young，MD，Kennedy，D.，Sargent，JL，Bertrand，JJ，Semmler，AB，Mellick，AS，Martin，PR，Alm，RA，Hobbs，M.，Beatson，SA， Huang，B.，Nguyen，L.，Commolli，JC，Engel，JN，Darzins，A.和Mattick，JS（2004）。复杂化学感应信号转导系统的特征，控制绿脓杆菌中的抽动运动。 Mol Microbiol 52（3）：873-893。
Zolfaghar，I.，Evans，D.J。和Fleiszig，S.M。（2003）。抽动动力有助于纤毛在由铜绿假单胞菌引起的角膜感染中的作用。感染免疫 71（9）：5389-5393。