材料和试剂

过滤纸（例如，过滤纸600号，VWR，目录号：516-0309）
（例如，18×25厘米，50微米聚乙烯foliezak遇到druksluiting，Vink Lisse，目录号：174718 49）
培养皿直径15厘米（例如，未处理的培养皿，康宁，目录号：430597）
Parafilm M（ eg ，BRAND ，Parafilm ，VWR，产品目录号：291-1213）< br />
玻璃瓶（图1）（例如，555ml带Twist-off装置的Twist-off罐TO82具有BPA NI盖， www.glazenflessenenpotten.nl ，GLAZEN RLESSEN EN POTTEN。NL，目录号：V2391WS和VC305）

图1.用于蓟马饥饿的玻璃瓶（高11.5厘米×直径7.5厘米）
同步的L1 / L2 Frankliniella occidentalis （Pergande）或<蓟马烟草（Lindeman）（缨翅目）
辣椒（Solanaceae）植物（任何品种）
琼脂（例如，Phyto琼脂，Duchefa Biochemie，目录号：P1003）
水
1.5％液体琼脂溶液（见食谱）

设备

对于 F，气候柜设置为25°C。 occidentalis 或23°C for T。 tabaci ，L16：D8灯光区域（，带有TL闪电的经济型Delux 432 L，Snijders Labs， http://www.snijderslabs.com ）
微波炉（Moulinex，型号：微型厨师FM2515Q）
直径1.5厘米的软木钻孔器（例如，带手柄的洪堡黄铜软木钻套装，Fisher Scientific，目录号：07-865-10B）
制造商：Humboldt Mfg。，目录号：H-9663。
烧杯50ml（例如，Griffin烧杯，Corning，PYREX®，目录号：1000-50）
软油漆刷（，例如，van Eyck油漆刷套装，1号刷子）
塑料镊子（例如，Azlon镊子 - 镊子，Dynalab Corp.，Dynalon Labware，产品目录号：516555-0001， https://www.dynalon.com/PublicStore/ ）
爱普生10000XL扫描仪（爱普生，型号：10000XL）或任何单反相机（1200万像素）与三脚架
2厘米间距的手工格子（图3）
黑纸（用于扫描仪）或黑布（用于单反相机）
已安装软件的笔记本电脑
精密天平（Sigma-Aldrich，产品目录号：Z267074）
制造商：Sartorius，型号：BP 310 S。
实验室瓶盖500毫升（DWK生命科学，杜兰，目录号：21 801 44 5）

软件

ImageJ Fiji 例如，版本2.0.0与Java 1.6.0_24
Ilastik版本1.1.3，
注：为了成功应用该协议，使用此确切版本非常重要。该软件可以在网上找到： files.Ilastik.org/1.1/ ，'ilastik-1.1.3 -win64.exe“，也可用于Linux和OSX。
Epson Scan Utility 例如，版本3.4.9.9
注意：只有在使用Epson扫描仪或使用其他扫描仪时才需要。

程序

蓟马制剂
收集同步的L1 / L2幼虫在实验前24小时内衬有3片稍湿润滤纸的玻璃瓶中。将玻璃瓶放入温度设定为25°C的气候柜中。 occidentalis 或23°C for T。 tabaci ，带有L16：D8灯光系统。这个24小时的饥饿期确保了在无选择叶盘测定开始后蓟马将开始直接进食。
无选择的叶盘测定法
1. 准备1.5％液体琼脂溶液（见配方1）
2. 收集温室植物的叶子并运送到实验室，使用密封的类似Ziploc的塑料袋盛装2毫升水，以保持叶片新鲜。
3. 。用微波炉加热琼脂，直至液化
4. 使用软木塞凿子冲压叶盘，同时避开中脉。
  中等蛋白通常有浅色块，可能导致不准确的蓟马损伤量化。
5. 将一部分琼脂溶液倒入烧杯中，并在培养皿中间倒入一小滴（约2厘米直径）的液体琼脂（图2A）。将叶盘置于琼脂上，使正面与琼脂完全接触。这确保蓟马只能在叶的远轴侧（“下侧”）进食。
  在琼脂变成固体之前将叶盘置于琼脂上（凝胶化温度在34-36℃之间，Duchefa Biochemie Safety Data Sheet P1003 2.0版）。
6. 用一把小画笔在每个叶片上放置五个蓟马（图2B）。
  在将蓟马置于叶片上之前，确保琼脂完全固化
7. 用Parafilm <®M>关闭培养皿并将它们置于气候箱中48小时（图2C）。
8. 48小时后，可以用小画笔去除蓟马，并可以获取叶盘的数字图像。＆nbsp;
  
  图2.叶盘试验的实验装置将叶盘置于琼脂（A）上，接种蓟马（B）并将闭合的培养皿置于气候箱（C）中的托盘中，。
获取图像
1. 将带有塑料镊子的叶片放在扫描仪上（如果使用单反相机，请将其放在黑布上）。
  1. 为了便于处理获取的图像，所有的叶片应该均匀分布，以便在ImageJ斐济使用一次单一的宏观运行就可以很容易地“切割”叶片。叶盘的均匀分布可以使用网格来实现（图3）。
  2. 放置在水平和垂直轴上的物体（叶片和标签）的总数应该相等（在我们的例子中：水平轴：3片叶片+1标签，垂直轴：4片叶片）。
  3. 当您使用协议时，建议包括未暴露于蓟马损伤的叶片（对照叶片），并分析这些叶片的方式与暴露于蓟马的叶片相同。 Ilastik有时高估了损伤的数量，例如，由于叶脉的存在。
    未损坏的叶盘图像可用于纠正这些错误。＆nbsp;
    
    图3.放置叶片。 A.使用扫描仪设置为1,200 dpi的TIFF图像示例。在这个例子中，水平轴和垂直轴用白色虚线标出以便说明。标尺包含在图像右侧进行校准。 B.可用于在扫描仪上平均分配单片光盘的手工纸张网格示例。
2. 使用黑纸覆盖放置在扫描仪上的叶片，并将扫描仪设置为1,200 dpi时获得叶片的TIFF图像。在可用于校准的扫描之一中包含校准方块（1 x 1厘米）或标尺（x像素= x毫米）。当使用单反相机时，以JPEG或JPG格式从给定距离拍摄照片（使用校正方块（1 x 1厘米或尺子））。
在ImageJ斐济切割扫描图像
1. 打开ImageJ斐济步骤C2中获取的扫描图像。点击'文件'，然后选择'打开...'或将选定的图像从一个文件夹直接拖到ImageJ斐济。
2. 打开一个宏，点击'插件'; '新'; '宏'（图4）。
  
  图4.在ImageJ斐济开设新宏
3. 在macro.ijm.ijm窗口中复制以下脚本（仅黑色文本）（图5）。以绿色突出显示的文本是来自作者的评论，不应包含在宏中。红色文本应该由用户完成。
  
  n = getNumber（ X，X ）;
  //填写必须在红色'X'的斑点上进行的切割次数。如果我们获得了扫描图像：n = getNumber（4,4）。
  id = getImageID（）;
  title = getTitle（）;
  getLocationAndSize（locX，locY，sizeW，sizeH）;
  width = getWidth（）;
  height = getHeight（）;
  tileWidth = width / n;
  tileHeight = height / n;
  for（y = 0; y
  offsetY = y * height / n;
  for（x = 0; x
  offsetX = x * width / n;
  selectImage（id）;
  call（“ij.gui.ImageWindow.setNextLocation”，locX + offsetX，locY + offsetY）;
  tileTitle = title +“[”+ x +“，”+ y +“]”;
  run（“Duplicate ...”，“title =”+ tileTitle）;
  makeRectangle（offsetX，offsetY，tileWidth，tileHeight）;
  run（“Crop”）;
  }
  }
  / / font-family：Courier New;“>
  imageCount = nImages
  for（image = 1; image <= imageCount; image ++）{
  selectImage（image）;
  //将活动图像的标题更改为字符串名称
  重命名（“test”+图片）;
  }
  //将所有切片保存在您想要的目录中（以红色标记），确保在文件夹名称之间使用两个反斜杠。 span>
  n = nImages;
  for（i = 0,1; i＆lt; n; i ++）{
  title = getTitle;
  saveAs（“TIFF”， X：\\ ... \\ ..... \ + title）; > close（）;
  }
  
  图5.运行宏。宏将ImageJ斐济的扫描图像剪切成单张叶片图像（切片）。
4. 点击'运行'运行宏。 ImageJ斐济现在会自动剪切并将单片光盘作为TIFF文件保存在您选择的目录中。单片光盘标有扫描标题和一个数字（Titelscanimage_1，Titelscanimage_2， etc。）。 ImageJ斐济开始从第一排左上角切出叶片，继续向右，然后从下一排开始。
5. 从宏观产生的图像（图6）可以在Ilastik
  中进一步分析
  
  图6.使用ImageJ Fiji剪切扫描图像后的单片叶片
培训Ilastik识别蓟马损害
1. 打开Ilastik并通过选择“像素分类”并为您的项目命名来创建一个新项目。
2. 现在通过单击“添加新的”导入带有单片光盘的扫描并选择“添加单独的图像...”（图7）。现在，您可以选择要在Ilastik中导入的计算机上的图像。图像输入速度为3.26MB /秒，采用Intel核心处理器i7-4910MQ CPU @ 2.90 GHz，RAM 16 GB（作为参考50张图像，每个3.08 MB需48张秒导入）。
  
  图7.将图像导入Ilastik
3. 您现在可以选择用于分析的功能。点击“选择功能”选项卡并选择功能。我们建议在ơ= 1.0 px（图8）上选择颜色/强度/纹理。
  
  图8.为Ilastik中的图像分析设置参数
4. 转到标签'训练'，选择'添加标签'并添加3个标签。一个将用于背景，一个用于叶盘，另一个用于实际的蓟马损害。颜色将由程序自动分配。如图9所示为您的标签命名。确保您保持相同的顺序，如屏幕截图所示（图9）;这对于以后的分析很重要。
  
  图9.添加分段标签
5. 现在您可以从培训计划开始。选择其中一个标签并标记与标签相对应的区域。使用红色来标记典型的蓟马损害区域，绿色未损坏的叶片区域和黄色的深色背景（图10A）。确保您使用多片叶片来培训课程。您可以通过从“当前视图：”旁边的下拉列表中选择图片编号或名称来切换到其他叶片光盘（图10B）。培训是一个重要的步骤，因为程序依赖于足够的培训来准确识别图像中的不同组件。训练可能需要半小时，训练图像处理速度大约为0.9 MB /秒（Intel核心处理器TM i7-4910MQ CPU @ 2.90 GHz，RAM 16 GB）。作为参考，蓟马受损区域标记大约10厘米（铅笔工具设置为3像素）对于准确学习是必需的。
  
  图10.在Ilastik中的训练阶段A.标记蓟马损伤（红色），叶盘（绿色）和背景（黄色）; B.在Ilastik中导入的图像之间切换。
6. 要检查训练是否足够，请点击' Live 更新'。现在这些区域的颜色对应于程序看到的蓟马损伤（红色/粉红色），叶片（绿色）和背景（黄色）（图11）。如果程序没有充分区分蓟马损伤，叶片和背景，请再次单击“生命更新”并取消选中“概率”（用红圈标记，图11）。如上所述在图片中添加更多标记并再次激活“生命更新”。对于黑暗和浅绿色的叶子，例如不同的叶片年龄，种质或品种，分别培养程序以确保最佳结果是明智的。在图12中提供了对Ilastik足够和不足的培训的例子。
  
  图11. Ilastik（A）培训阶段图像分割的实时视图
  
  图12. Ilastik培训示例A.原始叶片; B.在叶盘训练不足之后。在B中，蓟马损害被高估，例如，叶脉不正确地被标记为蓟马损害，并且叶脉上的区域也被视为不正确的蓟马损害。 C.在用Ilastik中的正确标签标记更多区域后，对叶片进行充分培训。
将图像转换为简单的分段
训练完成后，所有导入的图像都可以转换为JPEG文件，这些文件是原始图片的简单分段（黑色，灰色和白色图像）。
1. 转到“预测导出”选项卡，选择“导出源”“简单分段”。
2. 现在转到“导出设置”并点击“选择设置”。确保设置与图13中的相同。数据类型应该设置为“signed 8-bit”，输出文件格式为“JPEG”。确保您选择要保存输出文件的位置。确保设置正确后，点击“确定”。＆nbsp;
  
  图13.在Ilastik
  完成训练后的图像输出设置
训练后导出图像
1. 点击'全部导出'，程序将开始导出图像。这可能需要几分钟时间，具体取决于计算机的处理器和RAM模块（采用Intel Core™CPU i7-4910MQ @ 2.90 GHz时为0.9 MB /秒，RAM 16 GB，每个3.08 MB的50张图像需要171秒来分析）。导出的图像将包含黑色的蓟马损伤（红色）和灰色的叶片（绿色）（图14）。
  
  图14.导出原始图像的简单分割。黑色=蓟马损伤，灰色=叶片。
2. 不要忘记保存你的项目。如果在稍后的时间点想要使用相同的设置处理单张光盘的其他扫描，请转至步骤 H 。如果您已完成处理，请关闭程序并继续操作步骤我。
使用相同的设置处理Ilastik中的其他图像
1. 如果您想要使用相同的设置处理单张光盘的其他扫描，请使用与制作任何办公文件副本相同的方式制作项目的副本。
2. 打开项目的副本，然后点击“批量预测输入选择”。点击“添加新的”并导入您想要分析的附加图像。
3. 转到“批量预测输出位置”选项卡，并确保您按照步骤 F2 中所述使用相同的输出设置。如果您继续在原始项目中导入图像，该项目会变得非常大，并且需要对计算机进行大量处理，从而使您的计算机变慢。因此，在继续使用一组新图像之前，请确保您删除了在“批量预测输入选择”中导入的图片。＆nbsp;
在ImageJ斐济处理简单的分割图像
在这一步中，我们要提取灰色区域并创建仅包含黑色蓟马损伤的图像。
1. 打开ImageJ斐济并打开想要进一步分析的图像。点击'文件'，然后选择'打开...'或将选定的图像从一个文件夹直接拖到ImageJ斐济。
2. 按步骤 D1 中所述打开新宏，复制以下脚本并运行宏（仅限黑色文本）。
  
  imageCount = nImages
  n = nImages;
  for（i = 0,1; i＆lt; n; i ++）{
  ＆nbsp;＆nbsp; setAutoThreshold（“Default”）;
  ＆nbsp;＆nbsp;运行（“阈值...”）;
  ＆nbsp;＆nbsp; setThreshold（0，70）;
  ＆nbsp;＆nbsp; setOption（“BlackBackground”，false）;
  ＆nbsp;＆nbsp;运行（“转换为蒙版”）;
  title = getTitle;
  
  //给出想要保存输出图像的正确目录（标记为红色）
  saveAs（“TIFF”，“ X：\ \ ... \\ ... \\ “+ title）;
  close（）;
  }
3. 输出图像将包含黑色蓟马损伤（图15），并标记为与原始图像相同，因此请确保将它们保存在单独的文件夹中。
  
  图15.在ImageJ Fjij中提取叶盘后仅包含蓟马损害的图像
校准
在计算损坏表面积的数量之前，我们确定有多少像素等于10毫米。
1. 在ImageJ斐济打开包含校准正方形或标尺的图像。
2. 选择strait line选项，并在图像中绘制一系列可识别的尺寸（例如，标尺上为10 mm）（图16）。
  
  图16. ImageJ Fiji中的校准在ImageJ Fiji（A）中选择直线工具，并用尺子（B）在扫描图像中绘制代表10 mm的直线（用黄色）。< br />
3. 转到“分析”并选择“设置比例”。 ImageJ斐济生成一个窗口，显示有多少像素等于所画线条的长度（图17，标签'Distance in pixels：'）。在这个例子中，206.9034像素等于10毫米。
  
  图17. ImageJ斐济的窗口显示了与图15B相距10毫米的像素数
以毫米2确定受损表面积的数量2 / sup>
1. ImageJ斐济现在可以对受损区域进行量化。转到'处理'，选择'批'，然后点击'宏'。
2. 将以下脚本复制到打开的窗口中。确保您填写了在 J3 中获得的正确比例（用红色文本标记）。＆nbsp;
  
  setAutoThreshold（“Default”）;
  ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP;运行（“阈值...”）;
  ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; setThreshold（129,255）;
  run（“Convert to Mask”）;
  run（“Set Scale ...”，“distance = ＃像素已知= distance in mm pixel = 1 unit = mm”）;
  run（“Analyze Particles ...”，“show = Nothing clear include summary”）
3. 选择包含步骤 I3 中获取的黑白图像的文件夹，为输出选择不同的映射（图18）。 ImageJ斐济将生成保存在输出文件夹中的分析图像的副本。
  
  图18. ImageJ Fjij中的批处理
4. ImageJ斐济将提供您可以复制到Excel文件的测量摘要。它将包含5列：'切片'（图像名称），'计数'，'总面积'（总蓟马损伤以毫米2为单位），'平均尺寸'和'％面积' （图19）。将生成的数据复制到excel文件中。
  
  图19. ImageJ Fiji中的输出总结。输出显示列'Slice'中分析图像的名称以及列中总蓟马损伤（mm 2 ） '总面积'。

数据分析

在报告叶片蓟马损坏之前，您应该纠正Ilastik制造的平均误差。这个平均误差是通过计算没有蓟马的叶盘上的平均蓟马损伤（对照圆盘）来确定的。（表1）

更正资料

修正每片叶片的蓟马损害：
Image_1_T = 20 - 2 = 18
Image_1_T = 15 - 2 = 13
Image_1_T = 17 - 2 = 15

修正后的蓟马损害可用于进一步的统计分析。

表1.获得的数据的数字示例

食谱

1.5％液体琼脂溶液

在500毫升的实验室瓶中，将7.5克琼脂加入500毫升水中。
用微波加热瓶子直至琼脂完全溶解
注意：请将瓶盖丢在瓶子上，以免空气流失。否则由于气瓶内压力的增加，盖子可能会在微波炉中吹出。

致谢

这项工作得到了Stichting voor de Technische Wetenschappen（STW）的支持，该项目属于绿色防治害虫（GAP）项目1355项目的一部分。Nicole M. van Dam衷心感谢德国综合生物多样性研究中心（iDiv ）由德国研究基金会（FZT 118）资助的Halle-Jena-Leipzig。该方案已被用于Entomologia Experimentalis et Applicata（Visscher等人，<2018>）。该作者声明没有利益冲突。

参考

Bongiorno，T.，Kazlow，J.，Mezencev，R.，Griffiths，S.，Olivares-Navarrete，R.，McDonald，JF，Schwartz，Z.，Boyan，BD，McDevitt，T.C和Sulchek，T 。（2014）。机械僵硬度作为改善成骨细胞人类间充质干细胞分化的单细胞指标。 J Biomech 47：2197-2204。
Fabrowski，P.，Necakov，A. S.，Mumbauer，S.，Loeser，E.，Reversi，A.，Streichan，S.，Briggs，J.A.G。和De Renzis，S。（2013）。管状内吞作用驱动果蝇中上皮形态发生过程中顶端表面的重塑。 Nat Commun 4：2244.
Leiss，K.A.，Choi，Y.H。，Abdel-Farid，I.B.，Verpoorte，R.和Klinkhamer，P.G。（2009）。蓟马（ Frankliniella occidentalis ）的核磁共振代谢组学在Senecio hybrids。 J Chem Ecol 35（2）：219-229。
Maharijaya，A.，Vosman，B.，Steenhuis-Broers，G.，Harpenas，A.，Purwito，A.，Visser，R.G.F和Voorrips，R.E。（2011）。筛选辣椒种质对两种蓟马物种的抗性（ Frankliniella occidentalis 和蓟马parvispinus ）。 Euphytica 177：401-410。
Maharijaya，A.，Vosman，B.，Verstappen，F.，Steenhuis-Broers，G.，Mumm，R.，Purwito，A.，Visser，R. G. F.和Voorrips R.E。（2012）。胡椒中的抗性因子抑制蓟马的幼虫发育（ Frankliniella occidentalis ）。 Entomol Exp Appl 145：62-71。
Mirnezhad，M.，Romero-Gonzalez，R.R.，Leiss，K.A.，Choi，Y.H。，Verpoorte，R。和Klinkhamer，P.G。（2010）。野生和栽培西红柿中寄主植物对蓟马的抗性代谢组学分析 Phytochem Anal 21（1）：110-117。
Morrison，E.B。和Lindell，C.A。（2012）。鸟类和蝙蝠减少热带森林恢复地点的昆虫生物量和叶片损害。 Ecol Appl 22：1526-1534。
Meyer，G.A。和Hull-Sanders，H.M。（2008）。改变（一枝黄花）入侵基因型的生长，生理和繁殖模式。生物入侵 10：303-317。
Rasband，W. S.（2011）。 ImageJ，美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达 https：// imagej.nih.gov/ij/。
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P.和Cardona，A。（2012）。斐济：生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7）：676-682。
Sommer，C.，Straehle，C.，Köthe，U.和Hamprecht，F.A。（2011）。 Ilastik：交互式学习和分割工具包 2011年IEEE生物医学成像国际研讨会：从纳米到宏观，电气和电子工程师协会（IEEE），吉田校区，京都大学，日本京都，页数：230-233。
Visschers，I.G.S。，van Dam，N.M。，Peters，J.L。（2018）。使用Ilastik和ImageJ对蓟马损伤定量的客观高通量筛选方法。 Entomol Exp Appl （正在按）。