材料和试剂

CD34 ⁺单元格
外周血样（至少50ml）
葡聚糖溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D1037-500G）
PBS（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：14190-094）
Ficoll人（PAA Laboratories GmbH，目录号：P04-60500）
胎牛血清（FCS）（Hyclone，目录号：SV30160.03）
CD34 MicroBeads和FcR阻断试剂（Miltenyi Biotec，目录号：130-046-702）
APC小鼠抗人CD34抗体（BD Biosciences，目录号：555824）
EDTA
2％葡聚糖溶液
1 L 2％葡聚糖溶液（见配方）

设备

离心机
Auto MACS Pro分离器（Miltenyi Biotec）
30μm尼龙网（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
组织培养罩
流式细胞仪
真空过滤器单元（22μm，GP Millipore Express PLUS膜）

程序

外周血单核细胞（PBMC）分离
1. 在组织培养罩下，加入等体积的2％葡聚糖溶液和血液样品，并在室温下孵育45分钟（消除大多数红细胞）。
2. 收集上清液并以1,600rpm（ROTANA 460RF，转子5624Hettich）离心10分钟。
3. 弃去上清液并将含有淋巴细胞和粒细胞的沉淀重悬于10ml含0.1％EDTA的PBS中。
4. 将7.5 ml ficoll溶液加入到合适的离心管中，并用10ml来自步骤A3的细胞悬浮液小心地顶部
5. 以2200rpm离心20分钟。
6. 离心后有三个阶段：上层包含血浆和血小板。白色层含有单核细胞和下层相，颗粒含有粒细胞
7. 弃去含有血浆的上层水相，收集含有PBMC的白色层（约2ml），并将其重悬于50ml含0.1％EDTA的PBS中。
8. 计数PBMC。
9. 将PBMC以1200rpm离心10分钟，并将300μl含有0.1％EDTA的PBS中的1×10 8个细胞重悬浮。如果您有5 x 10 ⁷细胞，则需要重悬于150μl含0.1％EDTA的PBS中。
CD34磁性标记
1. 向300μlPBMC悬浮液中加入CD34 MicroBeads和FcR阻断试剂（各1×10 8个细胞各100μl）。 FcR阻断试剂用于避免非特异性标记。
2. 充分混合并在4℃孵育30分钟（或用30％FCS过夜）
磁分离与自动MACS分离器
1. 加入10 ml PBS 0.1％EDTA磁珠标记细胞，并在1,200 rpm离心10分钟
2. 弃去上清液并将细胞重悬于含有0.1％EDTA的PBS中（500μl，对于1×10 8个细胞）。
3. 使用30μm尼龙网过滤细胞以排除细胞团，并冲洗管，并用额外的500μl含0.1％EDTA的PBS过滤，收集最大细胞。
4. 将细胞通过自动MACS分离器，如用户手册（CD34 MicroBead Kit human）中所述。
5. 分离后，收集CD34 ⁺细胞并测定细胞数
6. 用5-10ml PBS 0.1％EDTA在室温下以1,200rpm洗涤细胞10分钟
7. 一旦洗涤，将细胞重悬在适当的细胞培养基中或将其冻结以备后用
CD34 ⁺细胞纯度评估
1. 取来自步骤C 4的10×10 3个细胞，并将它们重悬在100μl的PBS中。
2. 加入1μl的APC结合的小鼠抗人CD34抗体
3. 在4℃黑暗中孵育15-20分钟。
4. 用500μlPBS以1,200 rpm洗涤细胞10分钟。
5. 弃去上清液并将细胞重悬在300μlPBS中
6. 使它们通过流式细胞仪，并使用散射信号分析细胞用于APC标记，不包括死细胞和碎片

食谱

1L 2％葡聚糖溶液
将9g NaCl和20g葡聚糖加入到含有800ml去离子H 2 O的烧杯中
使用磁力搅拌器和磁力搅拌棒（约2小时）溶解NaCl和葡聚糖加入去离子H 2 O以使体积达到1L
在组织培养罩下，使用22μm孔真空过滤器
过滤2％葡聚糖溶液在4℃保存溶液

致谢

该协议先前已在Nakatake等人（2012）中公布。这项工作得到了来自"协会资助癌症（Projet libre 2012），Agence Nationale de la Recherche，计划Jeunes Chercheuses和Jeunes Chercheurs，卓越实验室Globule Rouge-Excellence的资金资助的方案"Investissements d' avenir"。HS得到了La Ligue Nationale Contrele Cancer的奖学金的支持。

参考文献

Nakatake，M.，Monte-Mor，B.，Debili，N.，Casadevall，N.，Ribrag，V.，Solary，E.，Vainchenker，W.and Plo， JAK2（V617F）通过在骨髓增生性肿瘤中通过La表达增强MDM2来负调节p53稳定。 Oncogene 31（10）：1323-1333。