材料和试剂

2毫升微量离心管（赛普拉斯
10 ml离心管，Snap-Cap（康健）
1毫升注射器（健氏）
注射器膜过滤器，0.22微米（金腾）
Synechocystis sp。 PCC 6803
氮（德海）
CO <2>（德海）
MilliQ水（德国Millipore）
磷酸氢二钾三水合物（K 2 HPO 4·3H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10017518）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10013018）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（国药集团化学试剂有限公司，产品目录号：20011160）
Critic acid（国药集团化学试剂，目录号：10007118）
柠檬酸铁铵（国药集团化学试剂，目录号：30011428）
EDTA·2Na（国药集团化学试剂，产品目录号：10009717）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（国药集团化学试剂，目录号：10019260）
硼酸（H 3 BO 3）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10004818）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：20026118）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10024018）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（国药集团化学试剂，目录号：10019818）
五水合硫酸铜（II）（CuSO 4·5H 2 O）（国药集团化学试剂，产品目录号：10008218）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2·6H 2 O）（国药集团化学试剂，产品目录号：10007216）
硝酸钠（NaNO 3）（国药集团化学试剂，目录号：10019918）
氯化钠（NaCl）（国药集团化学试剂，目录号：10019318）
乙醇（国药集团化学试剂，产品目录号：10009218）
甘油标准（99％，国药集团化学试剂，目录号：10010618）
葡萄糖基甘油标准（50％，Bitop， http://www.bitop.de / en / products / cosmetic-active-ingredients / glycoin ）
葡萄糖标准品（国药集团化学试剂，目录号：10010518）
蔗糖（国药集团化学试剂，目录号：10021418）
50％氯化钠（NaOH）溶液（赛默飞世尔科技）
BG11中（见食谱）
在BG11培养基中制备饱和NaCl溶液（见食谱）
80％乙醇（见食谱）
Osmolytes标准（见食谱）
200 mM NaOH（见食谱）

设备

200,1000毫升移液器（Eppendorf，德国）
玻璃柱光生物反应器（中国Sanhehuaxing）（Tan等人，2011年）
离心机（Sigma-Zentrifugen，型号：Sigma 1-14）
水浴（亚龙，型号：B260）
Organomation（Hengao，型号：HGC-24A）
离子色谱法（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Dionex TM ICS-5000 +）
Dinex TM CarboPac TM分析柱（4×250mm，Thermo Fisher Scientific，型号：Dinex TM CarboPac TM TM） PA10）
-80°C冰箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma 705）
Vortex-Genie 2（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
高压灭菌器（平山，型号：HV-50）

软件

Chromeleon软件（版本6.80，赛默飞世尔科技）
IBM SPSS Statistics（IBM，第19版）

程序

Synechocystis sp。的培养PCC 6803
注意：用分光光度计通过测量730nm处的光密度（OD <730> em>）来监测蓝细菌细胞的生长。 200 ml色谱柱的培养体积应小于150 ml。
1. 在玻璃柱光生物反应器中，在30°C恒定的白色荧光下，以100μE/ m 2 /秒/秒的光强度将集胞藻培养物接种到液体BG11培养基中。将初始OD <730> 调整为0.5。
2. 用CO 2浓化空气流（3％）使培养物鼓泡。
3. 将BG11培养基中制备的饱和NaCl溶液加入晚指数期培养物（OD730≈8-10）以达到600mM的最终NaCl浓度。
收获细胞：在室温下，以12,000×gg离心2ml等份的上述集胞藻属培养物5分钟。如果不立即进入下一步，细胞（图1A）可以保存在-80°C。
注意：经常在盐冲击后两天内达到集胞藻最高的细胞内葡萄糖甘油浓度。对于蔗糖，在盐冲击后约12小时达到最高浓度。如果不能立即提取细胞，则应通过离心将集胞藻细胞离心沉淀，并在-80°C冷冻箱中不含上清液。
从集胞蓝细胞中提取细胞内渗透物
1. 重悬于1ml80％乙醇（v / v）（图1B）中的集胞蓝细胞，然后在65℃孵育4小时。
  注意：在65°C孵育时，最好每小时颠倒一次混合样品。
2. 在室温下以12,000×g离心5分钟后，将上清液转移至干净的10ml管中，然后在55℃下在氮气流下干燥。
3. 将干燥的残留物（图1C）溶解在1毫升Milli-Q水中，并通过膜（0.22微米）过滤。
  注：为了干燥，大约需要30分钟。如果提取的样品（图1D）不能立即分析，应在4℃下保存少于7天（-20℃，少于30天），并在离子色谱分析前再次过滤。 em>
图1.从Synechocystis细胞中提取渗压剂A.用于渗压提取实验的集胞藻细胞 B.将集胞藻细胞重悬于80％乙醇中; C.干燥的残余物在55℃下在氮气流下干燥; D.从Synechocystis细胞提取的渗压液样品。
离子色谱法检测细胞内渗透物
1. 将提取的样品稀释至1〜20 mg / L的合适浓度。
  注：正常情况下，集胞藻中野生型细胞内的蔗糖和葡萄糖基甘油浓度是不同的。 PCC 6803约为100 mg / L。因此，样品应稀释5-10倍。
2. 将25μl样品加入配备有电化学检测器和Dinex TM CarboPac TM PA10分析柱的ICS-5000 +离子交换色谱系统（4×250mm，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。
  用200 mM NaOH以1.0 ml / min的流速洗脱色谱柱
3. 将葡萄糖甘油，蔗糖和甘油的标准混合，稀释成1,5,10,15,20 mg / L，并用提取的样品用相同的方法分析。
细胞内渗透物的定量
1. 对于含有15mg / L各渗透质的标准混合物，使用上述方法的甘油，葡萄糖基甘油，葡萄糖和蔗糖的保留时间分别为1.7,2.1,3.3和5.5分钟（图2A）。
2. 基于混合渗透压标准物，通过使用由Chromeleon软件计算的峰面积来制作标准曲线（图2B）。
3. 为了定量分析蓝细菌细胞内的渗透物质，用Chromeleon软件计算离子色谱法得到的目标峰面积，然后用渗压液标准曲线确定渗透物浓度。
  
  图2.离子色谱图和渗压剂标准品的标准曲线A.标准混合物的色谱图。将15mg / L各种渗透压标准品混合在一起并通过离子色谱分析。 Gly，甘油; GG，葡萄糖基甘油; Glu，葡萄糖; Suc，蔗糖。 B.从集胞藻细胞中分离的样品的色谱图。通过绘制每种渗压剂标准品的峰面积和浓度来确定甘油（C），葡萄糖基甘油（D），葡萄糖（E）和蔗糖（F）的标准曲线。

数据分析

为进行统计分析，使用了IBM SPSS Statistics 19版。
为了比较两个数据集之间的差异，进行了独立样本t检验。

食谱

BG11培养基（Rippka等人，1979）
1. 准备8种10x股票如下：
  库存1（40g / L K 2 HPO 4·3H 2 O）
  库存2（75g / L MgSO 4·7H 2 O）
  库存3（36克/升CaCl 2·2H 2 O）
  库存4（6克/升批评酸）
  库存5（6克/升柠檬酸铁铵）
  库存6（1g / L EDTA·2Na）
  库存7（20g / L Na 2 CO 3）
  库存A5（2.86g / LH 3 BO 3，1.81g / L MnCl 2·4H 2 O， 0.22g / L ZnSO 4·7H 2 O，0.39g / L NaMoO 4·2H 2 O， 0.08mg / L CuSO 4·5H 2 O，0.01g / L CoCl 2·6H 2 O）
  高压灭菌器1和5在121°C下保持20分钟。
  使用前将储存在4°C的高压灭菌的股票和其他股票
2. 将1.5g NaNO 3溶于992ml ddH 2 O中，分别向培养基中加入1ml储存液2,3,4,6,7和A5， >
3. 将培养基在121°C高压灭菌20分钟，并在接种前补充1毫升股票1和5。
在BG11培养基中制备的饱和NaCl溶液

在BG11培养基中溶解292.5克NaCl
使用BG11介质调整最终音量至1 L 将121℃的NaCl溶液高压灭菌20分钟
80％（v / v）乙醇
对于100毫升乙醇溶液，用Milli-Q水补充80毫升乙醇以达到最终体积100毫升
Osmolytes标准
1. 首先，将6毫克甘油，蔗糖，葡萄糖和葡糖基甘油溶解在100毫升Milli-Q水中
2. 然后，根据下表制备不同浓度的渗压剂标准物
3. 200 mM NaOH
  对于1 L的200 mM NaOH溶液，用Milli-Q水稀释16 ml 50％NaOH溶液至1 L的最终体积。
致谢

该方案从公开文本'Effects of reduced and enhanced glycogen pools on salt-induced sucrose production in a sucrose-secreting strain of the the homyces elongatus PCC 7942'（Qiao等人， 2017）。这项工作得到了中国杰出青年科学基金（31525002至X.鲁），山东省重点基础研究项目（ZR2017ZB0211），中德联合研究项目（授予GZ 984至X. Lu），中国科学院国家科学基金（31301018），中国科学院重点研究计划项目（ZDRW-ZS-2016-3至X.Tan），青岛创新领先企业山东泰山奖学金天赋（15-10-3-15-（31）-zch）。作者没有利益冲突或竞争利益声明。

参考
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3. Hagemann，M.，Richter，S.和Mikkat，S。（1997）。 ggtA基因编码在集胞蓝细菌中的渗透保护性化合物葡糖基甘油的转运系统的亚基， / em>的SP。菌株PCC 6803. J Bacteriol 179（3）：714-720。
4. Klähn，S.和Hagemann，M。（2011）。蓝藻中兼容的溶质生物合成 Environ Microbiol 13（ 3）：551-562。
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9. Slama，I.，Abdelly，C.，Bouchereau，A.，Flowers，T.和Savoure，A.（2015）。非生物胁迫下盐生植物中积累的渗透保护化合物的多样性，分布和作用 Ann Bot 115（3）：433-447。
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