材料和试剂

移液器吸头（USA Scientific，产品目录号：1110-3000，1110-1000，1111-2021）
T75烧瓶（Corning，Falcon ，目录号：353136）
100毫米TC处理的组织培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353003）
无菌注射器0.45μm过滤器（VWR，目录号：28145-505）
Beckman超清晰25 x 89 mm管（Beckman Coulter，目录号：344060）
Centricon Plus-70单元（Merck，目录号：UFC710008）
15ml Falcon管（Corning，Falcon ，目录号：352099）
1.5 ml Eppendorf管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
12孔板（Corning，目录号：3513）
24孔板（Corning，Costar ®，产品目录号：3526）
96孔板（Greiner Bio One International，目录号：650185）
无菌500毫升0.22微米过滤系统（康宁，目录号：430758）
29 ga。针头连接到0.5毫升注射器（Terumo Medical Corporation，Elkton，MD，USA）
BALB / c小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000651）
HEK 293T（ATCC，目录号：CRL-3216）
A20 B细胞淋巴瘤（ATCC，目录号：TIB-208）
pCMV-VSVG质粒（Addgene，目录号：8454）
pCMVΔR8.91质粒（Lifescience Market，目录号：PVT2323）
pFULGW（慢病毒荧光素酶-IRES-GFP质粒，可根据要求提供）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668027）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11058021）
达尔伯克磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，目录号：21-031-CM）
胰蛋白酶EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
聚凝胺（Sigma-Aldrich，目录号：TR-1003-G）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：P4864-10ML）
Bright-Glo TM萤光素酶测定系统（Promega，目录号：E2610）
D-萤光素，钾盐（Gold Bio，目录号：LUCK-1G）
异氟醚;雅培实验室（雅培公园，伊利诺伊州，美国）
胎牛血清（Corning，目录号：35-010-CV）
DMEM-高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6429-500ML）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
明胶，2％H 2 O，组织培养级（Sigma-Aldrich，目录号：G1393）
RPMI（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11875093）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
D10生长介质（见食谱）
2％明胶（见食谱）
D-Luciferin原液（见食谱）

设备

移液管（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17008653,17008650,17008649; Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：4641070N）
组织培养罩
组织培养培养箱（Eppendorf，New Brunswick，型号：Galaxy 170S）
带GFP滤光片的荧光倒置显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM IL LED）
FACS-Canto流式细胞仪（BD Biosciences）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
台式离心机（Eppendorf，型号：5810）
装备有SW-28转子（Beckman Coulter，型号：SW 28）的超速离心机（Beckman Coulter，型号：L8-80M）
余额（VWR，目录号：10204-990）
Xenogen IVIS成像系统（Perkin Elmer，Hopkinton，MA，USA）
桌面实验室动物麻醉系统（VetEquip，目录号：901806）
高压灭菌器

软件

采集软件（CellQuest，BD Biosciences）
分析软件（FlowJo v9.3，TreeStar）
生活图像软件（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA）
绘图软件（GraphPad Prism v7.0c，La Jolla，CA，USA）

程序

慢病毒质粒转染和病毒生产
1. 通过用2％明胶包被制备组织培养板（参见食谱）。用10毫升2％明胶溶液简单地冲洗每个10厘米的平板，并在通风橱中干燥。
  注意：同样的10毫升明胶溶液可以重复使用来涂覆几块板。
2. 在10ml D10生长培养基（参见配方）中以6-7.5×10 6个细胞/ 10cm平板转染前24小时在明胶包被的组织培养板上平板293T细胞。
  注：我们为每种慢病毒制剂准备4块板。
3. 用慢病毒（例如，pFULGW）和包装质粒（pCMV-ΔR8.91，pCMV-VSVG）转染293T细胞。
  备注：
  1. 由于其能够感染原代人类细胞，因此慢病毒被归类为生物安全级别2（BSL-2）生物体，并且实验需要在适当的设施中进行。
  2. 转染效率可通过使用倒置荧光显微镜对GFP表达进行成像来检查。
  1. 对于每个平板，在1.5ml Opti-MEM中制备60μlLipofectamine。
  2. 对于每个平板，还制备在1.5ml Opti-MEM中的13.3μgFULGW，10μgpCMV-ΔR8.91和6.7μgpCMV-VSVG。
  3. 将Lipofectamine和含有Opti-MEM的质粒混合在一起，并在室温下孵育25分钟。
  4. 每个平板移除2毫升培养基（现在总共8毫升）。
  5. 以逐滴的方式向每个平板添加3ml的Lipofectamine /质粒混合物，将混合物均匀地分布在平板上。
4. 在37°C孵育6 h，吸出培养基并加入10 ml新鲜D10。
5. 在48小时收获SN（培养基）并储存在4℃。再加入10ml新鲜的D10培养基并在转染后72小时再次收获。合并SN并通过在台式离心机中以2,000rpm（805×gg）离心5'进行澄清。然后通过0.45μm过滤器过滤SN，过滤器已用10 ml D10预湿。
6. 集中病毒。
  注意：根据BSL-2和机构指南，在使用慢病毒时应采取适当的遏制措施。
  1. 超离心法
    1. 将SN放入Beckman超清晰25 x 89 mm管（每个容量可达35 ml），并称重至百分之一克，以确保它们具有相同的重量，从而使转子达到平衡。 >
    2. 在SW-28转子中于4℃以25,000rpm（112,000×g克）旋转90分钟。
    3. 倒置管弃去上清液。将管保持在组织培养罩中的倒置位置，并从管壁抽吸剩余的流体以完全干燥，而不会干扰病毒颗粒。
      注意：颗粒很小，很难看见。
    4. 将200μl无血清培养基直接加入到病毒沉淀中，并使其在4°C下重悬12 h。轻轻吸管，以改善重新悬浮。
  2. 过滤方法
    1. 将SN置于Centricon Plus-70单元（Millipore，Bedford，MA）中。
      每个单位约有60毫升
    2. 使用台式离心机在15℃下以3,000rpm（1811gxg）离心2-2.5小时。
    3. 丢弃流量。
    4. 反转装置并在15℃下以1,500rpm（453×g克）旋转3分钟以收集病毒浓缩物。
7. 每个Eppendorf管分装20μl病毒，并保存在-80°C。
  注意：等分病毒有助于避免冻融循环，每个循环都会使MOI降低约50％。
滴度慢病毒
1. 一天前，将24孔板中的293T细胞以250,000个细胞/孔在0.5ml D10中平板培养。
2. 通过加入相当于每次制备物每孔10,3,1,0.3,0.1和0μl病毒浓缩物的转染细胞。
3. 2天后，通过用100μlPBS冲洗收集细胞，然后每孔加入100μl胰蛋白酶-EDTA并在37℃孵育5分钟。
4. FACS细胞并确定％GFP阳性。
5. 计算：
细胞系转导
1. 在无血清培养基中混合5-10 MOI的慢病毒和聚凝胺（6-8μg/ ml），并用它来代替12或24孔组织培养板中的细胞系培养基。以1,000×g（在台式离心机上〜2300rpm）在32℃转染3-4小时。
2. 在37°C孵育3小时，然后用新鲜培养基更换培养基。
3. 如果以较低的MOI开始，第二天重复病毒转导。
4. 培养2天，用FACS或荧光显微镜检查转导效率。在用FULGW转导后2天细胞中GFP表达是不均一的，并且随着培养时间的延长，其表达量会下降（图2A）。
  备注：
  1. 这种下降可能是由于没有病毒整合的未转导克隆或转基因丧失的竞争。
  2. 当通过FACS检测时，向FACS溶液中加入0.5μg/ ml的碘化丙锭以排除死细胞。
分离萤光素酶表达克隆
1. 将板转导的细胞放入圆底96孔板中，目标是每孔获得一个阳性细胞。完成此操作的最有效方法是在转导至含有100μl生长培养基的孔中2-3天后，FACS分选单个GFP表达细胞。或者，可以通过有限稀释的方法获得单细胞克隆。例如，通过用含有〜5个细胞/ ml的100μl生长培养基制备平板。
  注意：打印多个印版以确保足够克隆的发展。
2. 让细胞克隆生长约2周，在1周时再给他们100μl新鲜培养基。通过简单地寻找培养基变黄的孔或通过将培养板保持光线并在孔底寻找菌落观察克隆的生长情况。
3. 将克隆转移到24孔板并在几天内扩展。
4. 通过FACS分析测试GFP表达。来自单细胞的克隆将具有均匀，窄范围的GFP表达。选择具有不同表达水平的克隆进行进一步测试（图2B）。
  
  图2.通过FACS评估肿瘤细胞系转导A.用FULGW转导2天和2周后A20细胞中的GFP表达。 B.分离的A20-Luc / GFP克隆（＃1，12和20）表现出稳定和均一的GFP表达。
5. 测试萤光素酶活性。
  1. 将10,000个细胞放入圆底96孔组织培养板中。
  2. 向每个孔中加入一定体积的Bright-Glo TM试剂，该试剂的量等于孔中培养基的体积，并混合。对于96孔板，通常将100μl试剂加入到100μl培养基中的细胞中。
  3. 等待至少2分钟以使细胞裂解，然后测量发光计或IVIS系统中的发光（图3A和3B）。
6. 选择克隆并在培养两周后重新测试GFP和萤光素酶表达，以确保转基因稳定整合。
7. 将多个细胞系的等分试样冷冻并保存在液氮中以备将来使用。
  
  图3.荧光素酶表达的证实A.成像A20和A20-Luc / GFP B细胞淋巴瘤克隆＃1,20和12（来自每个克隆的10,000个细胞在圆底96孔板）中，并在添加D-荧光素之后使用IVIS成像系统测试萤光素酶活性。 B.每个克隆的发光量以每秒光子数（p / sec）定量。
图像萤光素酶细胞系体内
1. 确定细胞系是否能在体内高效生长很重要。
2. 将0.5-1×10 6 Luc / GFP肿瘤细胞皮下或静脉注射到相同遗传背景的小鼠中（例如对于A20细胞，BALB / c）。 /> 注：在肿瘤给药前4小时，可能需要预先照射4 Gy全身照射的小鼠，以允许某些菌株的肿瘤生长。
3. 通过用IVIS测量萤光素酶活性来量化肿瘤负荷（图4）。
  1. 用D-萤光素（150mg / kg，腹腔注射）注射小鼠并通过在麻醉室中暴露于4％异氟烷麻醉。
  2. 一旦镇静，将小鼠转移到IVIS成像系统样品室内的预热阶段，持续暴露于2％异氟醚流入鼻锥以维持镇静。
  3. 在注射底物后大约10分钟，图像小鼠并测量光子通量。
  图4.监测小鼠白血病模型中的肿瘤负荷在7和14天后通过IVIS成像的发光，A皮下（sc）注射1×10 6个A20- （iv）通过尾静脉注射注射5×10 5个A20-gfp / luc克隆后，在右侧腹腔注射gfp / luc克隆。
4. 根据以下公式，如果动物体重明显减轻（> 20％），出现后肢瘫痪或濒死，则以原发肿瘤达到〜1 cm3（从触诊估计）安乐死小鼠方法由您的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。对于通过触诊难以确定肿瘤负荷的静脉内注射的白血病模型，我们通常在测得的发光达到10 7 p / s时安乐死动物。
5. 作为对照，获得D-Luciferin注射后未处理小鼠中发光的基线测量结果。

数据分析

IVIS数据收集在感兴趣的区域，可以导出到Excel电子表格中进行分析。治疗组之间差异的显着性可以通过不配对的Student's t - 测试来确定。

食谱

D10生长介质
加入50ml热灭活的胎牛血清（FBS）至补充有谷氨酰胺和葡萄糖的450ml DMEM中。
2％明胶
将1mg明胶溶解在500ml H 2 O中并在121℃，15psi下高压灭菌30分钟。
D-Luciferin原液
在1x Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Life Technologies）中稀释至15mg / ml并无菌过滤（0.22μm）。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的赠款CA136934（Y.Y.），CA047741（Y.Y.），AI083000（Y.Y.）和AI101263（T.V.B.）的支持。利益冲突：作者声明不存在利益冲突。

参考

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