材料和试剂

1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
PCR管（SARSTEDT，目录号：72.985.002和65.986.002）
有化学能力的 E。大肠杆菌细胞（自制或New England Biolabs，目录号：C2987H）
DNA寡核苷酸，反相柱或HPLC纯化（Sigma-Aldrich，目录号：OLIGO）
PHUSION聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（Carl Roth，目录号：K039.1）
TOPO PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：451245）
质粒迷你试剂盒（Carl Roth，目录号：HP29.2）
限制酶（新英格兰生物实验室）
CloneJET PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：K1231）
琼脂糖凝胶提取试剂盒（Jena Bioscience，目录号：PP-202L）
DNA ladder（Promega，目录号：G5711）
LE琼脂糖（Biozym Scientific，目录号：840004）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
冰醋酸（Sigma-Aldrich，EMD-Millipore，目录号：27225-M）
EDTA，二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
去离子水
用于DNA电泳的10倍TAE（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，型号：Research Plus Plus，产品目录号：3123000918,3123000020）
PCR机TProfessional Basic（Biometra，目录号：070-701）
电泳设备（Bio-Rad Laboratories）

程序

在此，我示范性地描述了隔离miR-1839的miRNA海绵的产生，然而，通过相应地改变序列，可以靶向任何miRNA家族。海绵构建体本身通过串联PCR反应产生（图1），相应引物的设计将在下面进行解释。

图1.产生miRNA结合位点的串联重复的串联连锁反应的示意图（以mmu-miRNA-1839为例）在第一个PCR循环中，正向和反向引物与小的在延伸期间延伸的重叠。在随后的PCR循环中，这些延伸的寡核苷酸可以以不同的方式退火，即完全或部分重叠（步骤3），最终产生更长和更长的dsDNA片段。

底漆设计
1. 在 mirbase.org 检索您想要定位的成熟miRNA序列，例如。
  mmu-miR-1839 5'-AAGGUAGAUAGAACAGGUCUUG-3'
2. 在种子区域（位置2-8）之后标记四个核苷酸（位置9-12）。
  mmu-miR-1839 5'-AAGGUAGA UAGA ACAGGUCUUG-3'
3. 形成序列的反向互补序列并将RNA转化为DNA。
  mmu-miR-1839rc 5'-CAAGACCTGT > TCTA TCTACCTT-3'
4. 通过在标记位置缺失一个核苷酸并通过改变剩余的三个核苷酸（在本实施例中为TCTA），在您的海绵序列与待靶向的miRNA之间产生错配。 span>改为 GAT ）。这种不匹配会干扰RISC复合体的切片活性，并改善海绵体对miRNA的螯合作用。
  mmu-miR-1839rc_mismatch 5'-CAAGACCTGT GAT TCTACCTT-3'
5. 将连接子添加到寡核苷酸，例如 CCGT。
  海绵mmu-miR-1839F 5'-CAAGACCTGT GAT TCTACCTT CCGT -3' /> 这是海绵PCR的第一个引物（见下文）。
  注意：尽管我们在所有海绵中使用了CCGT连接器，但其尺寸，序列或GC含量方面没有明显的限制。然而，应该记住，如果接头序列本身与其周围的序列一起对应于microRNA种子区域，则接头序列本身可能意外地起海绵的作用。因此，我们建议使用RegRNA 2.0工具（Chang et al。，2013; http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection.html ）。
6. 形成引物海绵mmu-miR-1839F的反向补体。
  5' - ACGG AAGGTAGA ATC ACAGGTCTTG- br />
7. 将序列拆分到接近中间的位置，并在后半部分复制下半部分的序列。
  5' - ACGG AAGGTAGA ATC ACAGGTCTTG-3'
  海绵mmu-miR-1839R 5' - ATC ACAGGTCTTG ACGG AAGGTAGA-3' /> 这是海绵PCR的第二个引物。
8. 从您选择的公司（例如，Sigma-Aldrich）订购两种引物，至少在反相柱纯化质量中。
  评论：串联PCR反应的引物序列直接来源于成熟miRNA的序列，即除了接头序列外，在设计过程中基本上没有灵活性。因此，建议最佳引物T m 性质是没有意义的。然而，对于我们直到今天所产生的所有海绵构造，串联PCR一直在36℃的退火温度下工作（参见下文）。
海绵克隆
1. 使用设计的引物进行第一轮PCR，并使用以下条件（详见White et al。，1991）。
  
  0.2μldNTPs（每种25 mM） 0.5μlPHUSION聚合酶
  6μlGC缓冲液（随聚合酶一起提供）
  0.75μl海绵体正向寡核苷酸（10μM）
  0.75μl海绵反向寡核苷酸（10μM）
  H 2 O加30μl
  
  PCR程序：
2. 使用第一次PCR的等分试样作为第二轮PCR的模板
  0.2μldNTPs（每种25 mM） 0.5μlPHUSION聚合酶
  10μlGC缓冲液（随聚合酶一起提供）
  5μl模板（第一轮未纯化的PCR）
  0.75μl海绵体正向寡核苷酸（10μM）
  0.75μl海绵反向寡核苷酸（10μM）
  H 2 O加至50μl
  
  PCR程序：
  
  预期结果：在串联连锁反应（图1）中，每个PCR循环扩展了现有的DNA链，从而增加了更多的连接单位。然而，这种扩展不是“同步”的，即第二次PCR不会产生确定大小的DNA片段，而是产生具有不同数量的连环重复的dsDNA片段的混合物。因此，您应该在琼脂糖凝胶上看到DNA片段，它实际上代表了一个片段的DNA梯形，其长度与一个连续重复序列的长度不同（图2）。我们通常瞄准约750bp的条带大小，其编码约30个miRNA结合位点（例如miR-1839海绵的串联重复，长度为21bp + 4bp的接头;
  25个碱基对×30个重复序列产生750bp的片段）值得注意的是，串联连锁反应的效率对于每组寡核苷酸都不相同。因此，第二次PCR中的15个循环可能太低（凝胶上没有或只有非常小的PCR产物）或太高（图2，泳道3和4）。如果是这种情况，则相应地调整第二次PCR的循环次数，即，将第二次PCR的循环次数分别增加或减少到20和10或甚至5次。 < br />
  
  图2.第二轮PCR之后扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶，用于三种不同的海绵构建体。泳道1：大小标记。泳道2：具有DNA片段大小的特征分布的串联PCR的产物。可以容易地从凝胶中分离约750bp的片段（由虚线矩形表示），对应于约30个miRNA结合位点。泳道3和泳道4：两个海绵的实例，其中第二次PCR具有15个循环产生超出预计大小的DNA片段。为了分离约750bp的片段，第二次PCR需要重复5或10个循环的扩增。
3. 切割适当大小的凝胶片，使用琼脂糖凝胶提取试剂盒（Jena Bioscience）根据生产商的方案纯化DNA片段，并通过钝端亚克隆将其纯化成选择的载体，例如，通过TOPO克隆（Thermo Fisher Scientific）转化成pCR-BluntII-TOPO或通过CloneJET PCR克隆（Thermo Fisher Scientific）转化成pJET1.2。
4. 使用Miniprep Kit扩增选定的克隆并分离质粒DNA。
5. 通过DNA消化和测序验证克隆，特别是关于插入大小。
6. 将荧光和/或遗传标记的海绵片段3'克隆到您选择的表达载体中。根据上面提到的例子，片段应该按以下方式定向：
  5' - [荧光/遗传标记] - [CAAGACCTGT GAT TCTACCTT CCGT ] n -3'
  我们通常使用pMIG衍生的逆转录病毒载体，其中逆转录病毒LTR与pPGK启动子一起转录PAC（赋予嘌呤霉素抗性）-IRES-dsRed-海绵盒，使得能够通过流式细胞术选择以及鉴定海绵表达细胞，或者显微镜（Lindner等人，2017）。然而，只要其启动子引起相当高的海绵表达，每种表达载体都应该是很好的（另见Gentner等人，2009）。
miRNA海绵的功能验证
根据我们的经验，miRNA海绵的表达不一定导致miRNA水平降低，即，即使miRNA：RISC复合物与海绵的结合并不总是诱导miRNA衰变。因此，通过Northern印迹或qPCR定量的成熟miRNA水平（例如，）是海绵功能的较差指标。如果已知的经过验证的miRNA靶基因是已知的，则其表达水平可以通过PCR定量。如果海绵能成功隔离特定的miRNA：RISC复合物，则内源性靶mRNA应该稳定。这甚至可以通过蛋白质印迹确定更高的蛋白质表达。
如果没有目标基因是已知的，或者如果不清楚该基因受到待分析miRNA调控的程度，我们会定期验证荧光报告基因的海绵功能。这些报告基因在编码荧光蛋白的cDNA的3'-UTR中含有完美的互补miRNA结合位点（Lindner等人，2017）。
预期结果当在选择用于表达不同GFP报告基因的细胞中表达时（图3），基于dsRed的海绵构建体应该对缺乏miRNA结合位点的对照报道分子或另一个miRNA的记者。然而，在海绵将来自相应报道分子的miRNA：RISC复合物隔离的细胞中，GFP表达应该显着增加，表明内源miRNA靶标的去阻遏。值得注意的是，这种类型的实验一直在我们手中高度可重现，导致生物变异很小。因此，对于大多数miRNA海绵来说，只有少数生物学复制才能达到统计学上显着的报道抑制效果，例如，这是通过学生的测试来测定的。

图3.选择用于表达基于GFP的对照报道分子，miR-26a的报道分子和miR-21的报道分子的前体B细胞，用靶向miR-26家族的基于dsRed的海绵构建体逆转录病毒转导。密度图显示了门控策略，区分转导的dsRed阳性细胞（上门）和非转导的dsRed阴性（下门）群体。直方图叠加显示仅在与miR-26海绵一起表达miR-26a报道基因的细胞中表明miRNA活性降低的移动。

食谱

用于DNA电泳的10倍TAE

48.4克Tris碱
冰醋酸11.4毫升 3.7克EDTA，二钠盐
将所有组分溶解在800毫升去离子水中并填充至1升。稀释1:10进行电泳

致谢

该协议以前在Lindner等人（2017）中使用，该协议由Deutsche-Forschungsgemeinschaft通过Grant EXC294（生物信号研究中心，BIOSS），Tiroler Zukunftsstiftung和精英博士后巴登 - 符腾堡州基金会的计划。作者声明没有利益冲突。

参考

Chang，H.，Yi，B.，Ma，R.，Zhang，X.，Zhao，H。和Xi，Y.（2016）。 CRISPR / cas9，一种新的基因组工具，可在体外敲低microRNA 和 in vivo 。 Sci Rep 6：22312.
Chang，T.H.，Huang，H.Y.，Hsu，J.B。，Weng，S.L.，Horng，J.T。和Huang，H.D。（2013）。一种增强的计算平台，用于调查调控RNA的作用和识别功能性RNA基序。
Ebert，M. S.，Neilson，J.R。和Sharp，P.A。（2007）。 MicroRNA海绵：小分子RNA在哺乳动物细胞中的竞争性抑制剂 Nat Methods 4（9）：721-726。
Gentner，B.，Schira，G.，Giustacchini，A.，Amendola，M.，Brown，B. D.，Ponzoni，M.和Naldini，L。（2009）。慢病毒载体稳定敲除microRNA 。 Nat Methods 6（1）：63-66。
Krützfeldt，J.，Rajewsky，N.，Braich，R.，Rajeev，K. G.，Tuschl，T.，Manoharan，M.和Stoffel，M。（2005）。用'antagomirs'在体内沉默microRNA 。 438（7068）：685-689。
Lindner，S.E.，Lohmuller，M.，Kotkamp，B.，Schuler，F.，Knust，Z.，Villunger，A。和Herzog，S。（2017）。 miR-15家族加强了前B细胞从增殖向分化过渡。 EMBO Rep 18（9）：1604-1617。
Scherr，M.，Venturini，L.，Battmer，K.，Schaller-Schoenitz，M.，Schaefer，D.，Dallmann，I.，Ganser，A。和Eder，M。（2007）。用于特异性抑制miRNA功能的慢病毒介导的antagomir表达。核酸Res 35（22）：e149。
White，M.J.，Fristensky，B.W。和Thompson，W.F。（1991）。串联连锁反应：Taq DNA聚合酶介导的产生长串联重复DNA序列的机制。 Anal Biochem 199（2）：184-190。