材料和试剂

移液器吸头
完美的循环（电子显微镜科学，目录号：70945）
50毫升一次性离心管
Eppendorf管
无菌移液器
血清Acrodisc 37mm注射器过滤器（Pall，目录号：4525）
明胶胶囊1号直径6.5毫米-0.5毫升（TAAB，目录号：C089 / 1）
GEM ®单刃刀片3面0.009英寸/0.23毫米（AccuTec刀片，目录号：62-0179-0000）
酿酒酵母菌株RS453（ema ade2-1 his3,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3 52）和pah1Δnem1Δ（Nem1的SwissProt ID是P38757）（pah1Δ ::TRP1nem1Δ:: RS453的HIS3衍生物）（Choi等人，2011; Barajas等人，2014b）
Zymolyase 20T（Arthrobacter luteus）（Amsbio，目录号：120491-1）
氯化金（III）≥99.99％（Sigma-Aldrich，目录号：379948）
戊二醛50％（TAAB，目录号：G015）
乙醇干燥（Merck，目录号：1009901001）
LR-White树脂中等级丙烯酸树脂（TAAB，目录号：L012）
Bacto TM酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
Bacto TM蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211677）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05038）
D - （+） - 半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
乙酸锂99.95％（Sigma-Aldrich，目录号：517992）
ssDNA（来自鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号：D1626）
PEG MW3350（聚乙二醇）（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
Trizma半硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T8379）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：DTT-RO）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：10197777001。
不含氨基酸的酵母氮碱（Sigma-Aldrich，目录号：Y0626）
不含色氨酸的酵母合成辍学培养基补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1876）
D-山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
Tris（碱）（Norgen Biotek，目录号：28029）
多聚甲醛EM（TAAB，目录号：P026）
NaOH
10倍PBS
1,4-哌嗪二磺酸，哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸），哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
乙二醇 - 双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N' - 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
YPD（见食谱）
YPG（见食谱）
转化组合（见食谱）
TSD还原缓冲液（见食谱）
原生质球培养基A（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）溶液（见食谱）
PHEM溶液，pH 6.9（见食谱）

设备

500毫升烧瓶
移液器
钻石刀45°DIATOME（Fedelco）
QUANTIFOIL ® R 3.5 / 1 100多孔碳膜网格Au 300 mesh（Quantifoil）
配备摇床的Oven Memmert UN 55（Memmert，型号：UN55）（Genesys）
分光光度计722N（Terra Universal，实验室设备，型号：722N）
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R）
离心miniSpin plus（Eppendorf，型号：MiniSpin ®）加上）
超声波清洗机1510（布兰森，型号：1510）
pH计Basic 20（HACH LANGE SPAIN，Crison，型号：Basic 20）
通风柜（Flow-Tronic）
超薄切片机（徕卡显微系统，型号：Leica EM UC6）
在100 kV下运行的Jeol JEM 1011电子显微镜（JEOL，型号：JEM-1011）
FEI Tecnai G2 F20（200 kV）电子显微镜（FEI）
Tecnai Spirit Twin（120 kV）电子显微镜（FEI）

软件

IMOD软件。
Amira软件

程序

酿酒酵母菌株的转化
1. 从酵母提取物蛋白胨右旋糖（YPD）琼脂平板上的甘油储备物中筛选酵母菌株。在30°C培养细胞1-2天。接种10 ml YPD溶液，并加入带有环的单菌落。
  在30°C以250转/分钟（OD约2）培养过夜。
2. 在50ml YPD培养基中过夜培养至OD 0.2-0.3 注意：使用500毫升烧瓶。
3. 在30℃，250转/分的条件下培养3-4小时。
4. 在室温下将细胞在3,590×g下离心5分钟。使用50毫升一次性离心管。
5. 弃去上清液并加入1ml无菌dH 2 O，轻轻涡旋，然后用无菌dH 2 O充满管。
6. 将细胞在3,590×g下离心5分钟。使用50毫升一次性离心管。
7. 丢弃上清液，并在1毫升100mM醋酸锂中重悬沉淀。
8. 将细胞转移到Eppendorf管中并以3,590×gg离心2分钟。弃去上清液并将细胞沉淀溶解在0.4ml 100mM乙酸锂中。在室温下孵育10-15分钟。
  注意：使用无菌移液管。
9. 添加1-5微升质粒DNA（5-10微克）到每个新鲜的Eppendorf管
10. 弥补转化的主要组合（见食谱）。
11. 向含有质粒的每个Eppendorf管中加入0.4ml转化混合物。轻轻涡旋2秒以混合组分。
  注意：确保酵母细胞重新悬浮。
12. 在30°C孵育细胞（不摇动）30分钟
13. 在42°C孵育细胞（不摇动）40分钟。
14. 在570gxg离心细胞2分钟。弃去上清液并加入100μl无菌dH 2 O 2。轻轻地上下吸取分散沉淀，并用合适的选择培养基将细胞分配到琼脂平板上。
  在30°C孵育平板2-3天。
  注意：尝试用几个笔划传播单元格。
细胞培养
1. 在2ml酵母提取物蛋白胨半乳糖（YPG）中预培养酵母并在30℃和250rpm下孵育过夜。
2. 在YPG中于23℃和250rpm下在锥形瓶中培养50ml酵母细胞24小时。
  注意：这些条件对诱导和维持病毒复制是必需的。
3. 在600nm（OD 600nm）下测量和控制光密度，并且当OD 600约为2个收获细胞时，通过离心5分钟，4,000×gg / ，室温下，小心取出上清液。
4. 在含有二硫苏糖醇（DTT）（TSD）还原缓冲液的Tris-硫酸盐中以5至10OD 600个单位/ ml重悬细胞并在室温下孵育10分钟。
  注意：
  1. DTT通过破坏二硫键促进细胞壁消化，并使β-葡聚糖键更易接近裂解酶中存在的β-葡聚糖酶活性。
  2. 如果细胞在不同的OD处理，实验结果将会改变。
5. 在30°C下用0.1mg / ml的酵母裂解酶20T孵育酵母细胞10分钟以获得原生质体
  注意：
  1. 最佳的酶解浓度和消化时间取决于酵母菌株和生长条件。设置酵素裂解酶处理对于充分保存细胞超微结构至关重要。
  2. 在发酵裂解酶处理之前，在超声波清洗器中超声处理细胞5秒以避免酵母聚集是很重要的。
6. 在280gxg离心原生质球5分钟并除去上清液。
7. 用冰冷的原生质球培养基A洗涤3次。
黄金治疗和固定
1. 在室温下在黑暗中用原生质球培养基A中的2mM HAuCl 4 4孵育活的原生质球75分钟。
  注意：
  1. 4 解决方案，溶解于避光的蒸馏水和无菌水中。
  2. MT结合金原子并构建TEM可见的纳米团簇。
  3. 由于金盐在真核细胞中的潜在毒性，调整黄金处理条件非常重要。
2. 用原生质球培养基A清洗细胞。
3. 用PHEM溶液中的4％多聚甲醛和0.2％戊二醛在室温下固定细胞1小时。
4. 固定后用PHEM洗涤原生质球3次。
嵌入
1. 在10分钟步骤中脱水细胞，在4℃下用1ml乙醇（30,50,70,90％和100％两次）浓度递增。
  步骤之间的离心是不必要的。
2. 在室温下将细胞在乙醇-LR-白色树脂（2:1,1:1,1:2）的混合物中在摇动振荡器中各自孵育1小时并避光。
  注意：请勿将LR-White树脂暴露在光线下，并在通风良好的通风橱内操作。
3. 从乙醇 - 树脂混合物中取出细胞，并将它们置于100％树脂中24小时。
4. 在明胶胶囊中于60°C下聚合48小时。
超薄切片
1. 除去明胶胶囊并用剃刀修剪样本制作空中飞人。
2. 在300目Quantifoil多孔碳网格上收集50-60 nm超薄切片。
3. 在透射电子显微镜下观察标称放大倍数为30,000-50,000倍的切片。
  注意：通过透射电子显微镜观察切片而不染色，以避免掩盖小型MT-金纳米团簇。
电子断层扫描和图像处理
1. 获取半厚切片（〜300 nm）并将它们收集到Quantifoil网格上。
2. 在FEI Tecnai G2 F20和Tecnai Spirit Twin显微镜上分别以-60°至+ 60°的角度范围以1.5°的增量自动获取倾斜系列，加速电压分别为200和120 kV。
3. 使用IMOD软件对齐倾斜系列和层析重建。
4. 对于断层扫描分割和三维重建，使用Amira软件。
  注意：降噪和自动分割软件有助于突出膜的可视化。

数据分析

我们使用METTEM方法在酵母细胞中可视化Tombusvirus复制酶p33。图3中的电子显微镜成像显示p33-MT-金分子在与过氧化物酶体衍生的多泡体（MVB）相容的膜室中的精确定位，所述多泡体是植物和酵母细胞中的Tombusvirus复制细胞器（Barajas等人。，2014a）。采用这种方法，我们可以在复制平台内的ER膜中检测p33-金属硫蛋白 - 金纳米颗粒（图3A和3B）。

图3. METTEM可视化p33-MT-金分子切片未被染色，以避免掩盖MT-金纳米簇。 A.在tombusvirus复制区室内，p33-MT-金纳米颗粒（〜1nm）描绘了膜（箭头）。单个MT群集标有箭头。 B.具有p33-MT-金纳米簇内部（箭头）和周围内质网（ER）膜的Tombusvirus复制平台。比例尺= 200纳米。

为了更精确的细节，我们用电子断层扫描研究了三维病毒复制细胞器（图4）。断层图显示了病毒复制复合物中p33-MT-金分子的内部组织。病毒复制酶分子分布在复制隔室不同区域中的多种聚集状态（图4）（Fernandez de Castro等人，2014和2017）。

图4.病毒复制细胞器的电子断层成像A.复制平台的3D模型。以黄色显示膜，红色显示p33-MT-金分子（箭头）。 B.对应于复制平台的计算断层切片显示在A中。箭头指向膜内p33-MT-金分子的聚集体。纳米团簇的近似直径为1纳米。比例尺= 100纳米。

笔记

分析感兴趣的蛋白质的序列，以确定插入MT标签的最佳位点。另外，测试MT-标记的蛋白质活性和功能是否受到影响是相关的。
调整系统中表达MT标记蛋白质的最佳条件。
进行初步的EM研究以熟悉细胞类型的超微结构。这将有助于数据解释。
检查金盐不会在待处理细胞的培养基中沉淀。
用金盐孵育没有MT标记蛋白质的对照细胞并可视化电子显微镜以验证缺乏非特异性背景。
在没有染色剂的情况下使用丙烯酸树脂（如LR White或Lowicryl）以显示MT-纳米簇。
用特异于MT-标记的蛋白质的抗体进行免疫金标记以确认标记特异性。

食谱

YPD
10克酵母提取物
20克蛋白胨
20克葡萄糖（葡萄糖）
将dH <2> O加入1000毫升并充分混合
高压灭菌器消毒
对于平板添加20克琼脂/ L
YPG
10克酵母提取物
20克蛋白胨
20克半乳糖
将dH <2> O加入1000毫升并充分混合
高压灭菌器消毒
对于平板添加20克琼脂/ L
转型组合
0.36毫升1M乙酸锂
0.1ml 10mg / ml ssDNA
0.69毫升dH 2 O 0 2.4毫升50％PEG MW3350
将dH <2> O添加至10 ml
TSD减缓缓冲区
0.1MTrizma半硫酸盐，pH 9.4
10 mM DTT（在使用前添加）
原生质球培养基A

1x酵母氮基 2％（w / v）葡萄糖
1x氨基酸
1 M山梨醇
20mM Tris-HCl，pH7.5

在室温下储存4周
4％多聚甲醛（PFA）溶液
1. 在60°C下将4 g PFA溶于90 ml蒸馏水中
2. 加入1N氢氧化钠溶液直至溶液透明并且没有沉淀
3. 然后取出加热并在冰上冷却。
4. 加入10毫升的10x PBS，并加入蒸馏水至100毫升
5. 控制温度并避免将溶液加热到70°C以上，因为PFA会在较高温度下分解。
6. 用37毫米注射器过滤器过滤溶液
7. 立即使用该溶液或在4°C或-20°C下储存1天
PHEM溶液，pH 6.9
20 mM PIPES
50 mM HEPES
20 mM EGTA
4mM MgCl 2 2/2
在4°C储存数月

致谢

我们要感谢JoséJesúsFernández和Peter Nagy博士提供专家建议和有益的讨论。这项工作得到了西班牙经济和竞争力部（MINECO-AEI / FEDER，EU）授予BIO2015-68758-R（至C.R.）的资助。该协议改编自Fernandez de Castro et。（2017）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Barajas，D.，Martin，I.F.，Pogany，J.，Risco，C.和Nagy，P.D。（2014a）。宿主Vps4 AAA + ATPase ESCRT蛋白在番茄丛矮病毒形成中的非规范作用复制酶
Barajas，D.，Xu，K.，de Castro Martin，I. F.，Sasvari，Z.，Brandizzi，F.，Risco，C.和Nagy，P. D.（2014b）。选择性氧化甾醇结合的ORP和VAP蛋白通过膜接触位点将甾醇引导至RNA病毒复制位点。 PLoS Pathog 10（10）：e1004388。
Bouchet-Marquis，C.，Pagratis，M.，Kirmse，R.和Hoenger，A。（2012）。金属硫蛋白作为冷冻电子显微镜的可克隆高密度标记。 J Struct Biol 177（1）：119-127。
Choi，H. S.，Su，W. M.，Morgan，J. M.，Han，G. S.，Xu，Z.，Karanasios，E.，Siniossoglou，S.and Carman，G.M。（2011）。磷酸化磷酸酶在酿酒酵母中调节其膜结合和生理功能：作为由CDC28（CDK1）编码的细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化的位点的SER 602，THR 723和AND SER 744的鉴定 / J> J Biol Chem 286（2）：1486-1498。
de Castro，I. F.，Volonte，L.和Risco，C。（2013）。病毒工厂：生物发生和结构设计 Cell Microbiol 15（1）：24-34。
de Castro Martin，I. F.，Fournier，G.，Sachse，M.，Pizarro-Cerda，J.，Risco，C.，＆amp; Naffakh，N.（2017）。流感病毒基因组通过改良的内质网和Rab11依赖性囊泡到达质膜。 / a> Nat Commun 8（1）：1396.
Delebecque，C. J.，Lindner，A. B.，Silver，P.A。和Aldaye，F.A。（2011）。用合理设计的RNA装配来组织细胞内反应。科学 > 333（6041）：470-474。
den Boon，J.A。，Diaz，A。和Ahlquist，P。（2010）。细胞质病毒复制复合物
Diestra，E.，Fontana，J.，Guichard，P.，Marco，S.和Risco，C。（2009）。用电子显微镜观察可克隆标记的完整细胞中的蛋白质 J Struct Biol 165（3）：157-168。
Fernandez de Castro，I.，Fernandez，J. J.，Barajas，D.，Nagy，P. D.和Risco，C。（2017）。功能性病毒RNA复制酶复合物细胞内组装的三维成像。 < J Cell Sci 130（1）：260-268。
Fernandez de Castro，I.，Sanz-Sanchez，L.和Risco，C。（2014）。用于相关光和电子显微镜检查的金属硫蛋白。方法细胞生物学 124：55-70。
Jonczyk，M.，Pathak，K.B.，Sharma，M.和Nagy，P.D。（2007）。利用替代亚细胞定位进行复制：在没有过氧化物酶体的情况下，tombusvirus复制转换到内质网。< / a> 病毒学 362（2）：320-330。
McCartney，A.W.，Greenwood，J.S.，Fabian，M.R.，White，K.A。和Mullen，R.T。（2005）。番茄丛矮病毒复制蛋白p33的定位揭示了过氧化物酶体 - 内质网分选途径。 Plant Cell 17（12）：3513-3531。
Mercogliano，C.P。和DeRosier，D.J。（2006）。使用金属硫蛋白形成金纳米簇：质谱和电子显微镜 J Mol Biol 355（2）：211-223。
Mercogliano，C.P。和DeRosier，D.J。（2007）。串联金属硫蛋白作为电子显微镜的可克隆金标签。 J Struct Biol 160（1）：70-82。
Miller，S.和Krijnse-Locker，J。（2008）。修改病毒复制的细胞内膜结构 Nat Rev Microbiol 6（5）：363-374。
Nagy，P.D。（2008）。作为模型寄主探索植物病毒与宿主的相互作用。 Annu Rev Phytopathol 46：217-242。
Nagy，P.D。（2016）。 Tombusvirus与宿主的相互作用：选择进化上保守的宿主因子将成为中心法庭。 Annu Rev Virol 3（1）：491-515。
Nagy，P.D.和Pogany，J。（2011）。病毒RNA复制依赖于选择的宿主因子 Nat Rev Microbiol em> 10（2）：137-149。
Risco，C.，Sanmartin-Conesa，E.，Tzeng，W.P.，Frey，T.K。，Seybold，V。和de Groot，R.J。（2012）。使用金属标记透射电子显微镜对真核细胞中蛋白质分子的特异性，敏感性，高分辨率检测。结构 20（5）：759-766。