材料和试剂

移液器吸头（USA Scientific，目录号：1126-7810）
1000μl大孔移液器吸头（USA Scientific，目录号：1011-9000）
BD精密滑翔针（BD，目录号：305155）
BD Slip Tip无菌注射器1 ml（BD，目录号：309659）
BD一次性针22 G（BD，目录号：305159）
Falcon 15ml锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352097）
Falcon标准组织培养皿（100mm培养皿）（Corning，Falcon ，目录号：353003）
Falcon 35毫米TC处理的Easy-Grip样式细胞培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353001）
Nunc Edge 2.0 96孔细胞培养板（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：167425）
3孔室幻灯片（IBIDI，目录号：80381）
Falcon聚苯乙烯微孔板TC处理的6孔板（Corning，Falcon ，产品目录号：353934）
4至8周龄的C57BL / 6J小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
70％乙醇
红细胞裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11814389001）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
包含抗体骨架蛋白，Fabp4和胶原蛋白II（R＆amp; D Systems，目录号：SC010）的小鼠MSC功能鉴定试剂盒
DPBS（10x），不含钙，不含镁（Thermo Fischer Scientific，Gibco，产品目录号：14200075）
16％甲醛（w / v），不含甲醇（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：28906）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：D1306）
VECTASHIELD Antifade固定介质（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，目录号：17144002）
链霉亲和素APC-Cy-7（BD，BD Biosciences，目录号：554063）
PE大鼠抗小鼠Ly-6A / E（BD，BD Biosciences，目录号：561076）
大鼠抗小鼠CD117（BD，BD Biosciences，目录号：561074）
V450小鼠谱系抗体鸡尾酒（BD，BD Biosciences，目录号：561301）
胎牛血清，合格，热灭活，USDA认可（FBS）（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM，目录号：10438034）
Iscove改良的Dulbecco's培养基（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：12440053）
牛小牛血清（GE Healthcare，Hyclone，目录号：SH30072.03）
表皮生长因子（R＆amp; D Systems，目录号：2028-EG-200）
血小板衍生生长因子（R＆amp; D Systems，目录号：220-BB-010）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
2-巯基乙醇（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM，目录号：21985023）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
驴血清（Sigma-Aldrich，目录号：D9663）
骨髓洗涤缓冲液（见食谱）
MSCs媒体（见食谱）
DPBS阻断解决方案（请参阅食谱）

设备

ErgoOne 100-1,000μl单通道移液器（USA Scientific，型号：7110-1000）
Eppendorf 5804台式离心机（Eppendorf，型号：5804）
BD FACSCanto II分析造血干细胞（BD，型号：BD FACSCanto II）
BD FACSAria II分选造血干细胞（BD，型号：BD FACSAria II）
NIKON Eclipse 90i显微镜捕捉免疫荧光图像（Nikon Instruments，型号：Eclipse 90i）
OLYMPUS IX53倒置显微镜捕捉鹅卵石区域的相位对比图像（奥林巴斯，型号：IX53）

软件

BD FACSDiva v8.0.1软件（BD Biosciences）
FlowJo软件（FLOW JO）
CellSens软件（奥林巴斯）
GraphPad Prism软件

程序

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养
1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议，通过CO 2窒息将成人C57BL / 6小鼠安乐死。用70％乙醇喷洒小鼠进行消毒。在后腿部分切开皮肤并暴露肌肉。切开骨盆关节并取下后腿。切开膝关节以将股骨与下肢下部分开。去除股骨的肌肉并切割股骨的末端以使其能够冲洗。
2. 将股骨转移至冰冷的清洗缓冲液中，用带有22 G针头的1 ml注射器，用冰冷的清洗缓冲液轻轻冲洗，直至所有细胞都被去除，骨骼呈白色。对另一只后肢重复同样的程序，并将来自两只股骨的细胞合并。
3. BM细胞在室温下在500mlxg的15ml锥形管中旋转5分钟。
4. 溶血红细胞使用红细胞裂解缓冲液。
5. 为了裂解红细胞，将从两个股骨获得的细胞悬浮在2ml洗涤缓冲液中并加入4ml红细胞裂解缓冲液。每分钟颠倒几次混合细胞10分钟。
6. 在室温下将试管在400×g下离心6分钟。
7. 弃去上清液并用10ml洗涤缓冲液重悬BM细胞，并在400×g下离心10分钟以除去裂解的红血细胞。重复此过程一次。
8. 从细胞沉淀中除去多余的洗涤缓冲液，并向细胞沉淀中加入10ml的MSC培养基。
  轻轻吸取培养基均匀混合细胞沉淀。
9. 在含有10ml MSCs培养基的100mm组织培养皿中平板1×10 7个细胞。
10. 在标准湿润的组织培养室培养箱中，用37℃的5％CO 2孵育细胞。
11. 间充质基质细胞开始粘附在塑料培养皿上，而其余的BM细胞漂浮在培养基中。
12. 培养三天后，用新鲜MSCs培养基更换培养基并培养细胞10至12天。
13. 在第一次媒体更换期间，大多数悬浮细胞被移除并且MSC开始粘附到盘底部。
14. 使用胰蛋白酶-EDTA将MSC从一个100mm培养皿继代培养到35mm培养皿中。第二代细胞没有任何其他类型的BM细胞，并准备好从第3代开始进行测定（图1）。
15. 由于MSC不具有高的分裂潜能，每次分次培养至随后的传代时将细胞分成1比2的比例并保持在35mm培养皿中直至进行测定。
  可以将MSCs传至五代而不会失去MSC功能。
16. 当准备好进行测定时，细胞可以随后传代到96孔平底板
  
  图1.小鼠骨髓间充质基质细胞塑料粘附的MSCs显示在相衬图像中。比例尺代表50微米。
小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定
1. 为了获得纯的MSC，亚培养塑料贴壁细胞至少三代。 MSC是多能细胞，可被诱导分化成成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。然而，培养的MSC由成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的混合物组成，并表达它们独特的标志物。在进行CAFC之前评估MSC的功能至关重要，因为丢失基因或暴露于各种环境可能会导致MSCs分化的差异。
2. 为了鉴定MSCs的多能性，在平板上铺板细胞并用抗体骨桥蛋白，脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）和胶原II染色，分别用小鼠MSC功能鉴定试剂盒鉴定成骨细胞，脂肪细胞，成软骨细胞。
3. 间充质干细胞的免疫荧光：用1×DPBS漂洗间充质干细胞一次，并在室温下用在1×DPBS中稀释的4％多聚甲醛（PFA）固定10分钟。
4. 用在1x DPBS中制备的0.2％Triton X-100对细胞透化3分钟并用封闭缓冲液DPBS封闭溶液封闭30分钟。
5. 轻轻地去除封闭溶液，并在4°C与第一抗体孵育过夜。脂肪细胞标志物：山羊抗小鼠FABP4抗原亲和纯化的多克隆抗体。软骨细胞标记：绵羊抗小鼠胶原II抗原亲和纯化的多克隆抗体。骨髓细胞标记物：山羊抗小鼠骨桥蛋白抗原亲和纯化的多克隆抗体。在含有0.1％BSA的1x DPBS中稀释一抗至1：500。
6. 用含有0.1％BSA的1x DPBS在室温下洗涤载玻片三次，每次洗涤10分钟。在室温下用含有0.1％BSA的1x DPBS稀释至1：1,000的二抗孵育至少2小时。使用驴抗山羊和驴抗羊IgG二抗。
7. 用含有0.1％BSA的1x DPBS在室温下洗涤载玻片三次，每次洗涤10分钟。
8. 最后一次洗涤后，将核染料DAPI以1：2,000在1x DPBS中加入5分钟以评估核形态。
9. 用1x DPBS洗涤3次，每次5分钟
10. 删除多余的DPBS并使用Vectashield安装介质安装幻灯片。
11. 使用任何免疫荧光显微镜以20倍物镜采集图像（图2）。
12. 来自野生型C57BL / 6J小鼠的脂肪细胞：软骨细胞：骨细胞的比率是60:20:20。
  
  图2.用抗体Fabp4，胶原蛋白II和骨桥蛋白染色的小鼠BM MSC的代表性图像，以鉴定存在于骨髓衍生的间充质基质细胞中的脂肪细胞，成软骨细胞和成骨细胞谱系细胞。比例尺代表10 μm。
小鼠骨髓的分离造血干细胞（HSC）
1. 用细胞表面标志物染色后，使用流式细胞术从骨髓单核细胞（BMMCs）中分离HSC，所述细胞表面标志物对Lineage鸡尾酒阴性并且对Sca-1，c-Kit（谱系阴性，Sca-1阳性，c-Kit阳性，LSK）呈阳性。 HSC也被称为LSK。
2. 使用洗涤缓冲液将细胞从骨骼中轻轻冲洗出来，从小鼠股骨获得BM细胞。
3. 通过在室温下以500μgxg离心5分钟，用洗涤缓冲液洗涤BM细胞两次。
4. 用3ml洗涤缓冲液重悬细胞并轻轻覆盖在6ml Ficoll-Paque PLUS的15ml锥形管中。
5. 小心地将稀释的细胞样本铺在Ficoll-Paque PLUS溶液上，并采取预防措施，避免混合细胞和Ficoll。
6. 在室温下400×g离心30分钟，缓慢加速并关闭制动器。
7. 用无菌吸管吸出含血浆和血小板的上层，使BMMC层不受干扰。
8. 使用无菌移液器将BMMC层转移到无菌离心管中。
9. 用清洗缓冲液清洗BMMC
10. 沉淀BMMC并用抗体谱系（Lin）混合物（针对CD3e，CD11b，CD45R / B220，Gr-1和Ter119的生物素化的抗小鼠抗体）进行第一次染色。加入2μl的每种抗体染色一百万个BMMCs。将细胞与抗体在4°C孵育20分钟。
11. 用骨髓洗涤缓冲液洗一次并沉淀细胞。
12. 此外，加入5μL荧光标记的链霉亲和素以结合谱系抗体。
13. 用缓冲液清洗BMMC一次并沉淀细胞。此外，加入2μlSca-1和c-kit与荧光染料结合染色一百万个BMMC。
14. Wash Triple（Lineage，Sca-1，c-kit）将BMMC偶联染色一次，并将1百万个细胞悬浮在1 ml洗涤缓冲液中进行流动分选。
15. 使用FACSDiva软件对BD FACS Aria II进行流式分类。
16. 使用FlowJo软件分析流式细胞术数据以检查LSK细胞的质量，如伪色图（图3）中所示。
  
  图3.从小鼠骨髓鉴定和分离造血干细胞的门控策略从小鼠股骨冲洗的骨髓细胞经Ficoll-Paque PLUS分离以分离骨髓单核细胞，然后用使用流式细胞仪鉴别和细胞分选HSC细胞表面标记。
鹅卵石区域形成细胞分析
1. 在使用流式细胞术分离LSK细胞之前，培养MSC以在35mm培养皿或6孔板中完成融合。
2. 第3至第6代之间的MSC应该用于电镀LSK细胞
3. 在测定当天，使用流式细胞术对所述骨髓LSK细胞进行分选（程序C）。
4. 沉淀分离的LSK细胞并用MSC培养基重悬。在悬浮有LSK细胞的培养基中更换培养皿中培养MSC的培养基。大约在35mm培养皿中融合的MSC上铺2×10 3 LSK细胞。
5. 在37℃，5％CO 2下在潮湿的培养箱中共培养细胞以使前体细胞在基质层下形成造血克隆。
6. 。鹅卵石区域早在5天就开始出现，可以在7天内出现
7. 通过替换一半的培养基每周喂养培养物两次。使用相差显微镜（图4）以10倍物镜拍摄相干黑暗造血克隆，并使用奥林巴斯cellSens软件等软件安装。
  
  图4.鹅卵石区域形成细胞分析的代表性图像 HSCs在融合的MSC层上培养形成鹅卵石区域。黄色箭头相消化细胞（在MSCs层下生长的真干细胞），蓝色箭头相明亮细胞（干细胞悬浮或松散地附着于MSC）和红色箭头-MSC（汇合细胞层粘附于塑料盘）。比例尺代表50微米。
CAFC有限稀释法
1. 限制性稀释测定法（LDA）在具有汇合MSC的96孔平底培养板中进行，LSK细胞的稀释液（0,10,30,90,270和810）在每个孔中以3倍差异进行。在每个稀释度的平底96孔板中的10个孔中平板MSC（图5A）。
  没有LSK细胞加入到0稀释孔中，它们作为阴性对照。
2. 用来自小鼠骨髓的独立衍生的MSC进行三个不同的LDA实验。
3. 如果它包含一个或多个鹅卵石区域，则评价为“正面”，如果不包含鹅卵石区域则评价为“负面”。
4. 鹅卵石区至少有6个细胞（彼此靠近）生长在基质下。虽然鹅卵石样细胞呈现为黑暗相，但由于光线的偏转，这些细胞在96孔板中表现为无瑕疵。
5. 只有阴性和阳性的稀释液才能用于频率分析（图5B）
  
  图5. CAFC有限稀释测定法A.在96孔平底板中进行CAFC测定。计数流动分选的LSK细胞并在平底96孔板中铺板在融合的MSC上。每个测定一式三份进行。在没有LSK细胞，90和270LSK细胞的孔中形成鹅卵石的代表性图像。比例尺表示100μm。一部分鹅卵石区域被放大了;比例尺表示50微米。在虚线圆圈中鉴定相消隐细胞，而在实心圆圈中鉴定相明亮细胞。相位暗淡和相位明亮的细胞需要在场才能称之为真正的鹅卵石区域。 B.如上图所示，在每个孔中测量相消隐细胞面积。对铺满鹅卵石区域的孔的百分比进行计数，并将其与每孔中铺板的LSK细胞的数量作图。
  文化保持两周，并在每周结束时对这些区域进行计数。

数据分析

使用GraphPad Prism软件绘制图表并分析数据。使用 t -test比较LDA中两组的平均值。

笔记

当冷冻保存时，MSC不具有高回收率。所以总是培养并用新鲜的MSC进行检测。
为了防止悬浮在培养基中的MSCs和LSK细胞破裂，请使用大孔径移液器吸头。
只有当MSC生长到完全融合时才进行CAFC检测。
将LSK细胞表面标记添加到悬浮于200μl或更少体积缓冲液的BMMC中。

食谱

骨髓冲洗缓冲液
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水制成1倍浓度（1x DPBS）
10％FBS

MSCs媒体

Iscove的改良Dulbecco的媒介	500毫升
牛小牛血清	20％
表皮生长因子（rmEGF）	10 ng / ml
血小板衍生的生长因子（rhPDGF）	200 ng /μl
青霉素 - 链霉素	1％
2-巯基乙醇	10 -4 mol / L

DPBS阻止解决方案
1x DPBS
1％Triton X-100
1％DMSO
1％BSA
1％血清（来自二次抗体产生的动物的血清）

致谢

该协议是根据de Haan和Ploemacher于2002年发表在“造血干细胞方案”（Hematopoietic Stem Cell Protocols）中的以前的工作改编的。 LSK细胞的细胞分选在Cincinnati儿童医院医疗中心的研究流式细胞核心处进行。这项调查得到了美国国立卫生研究院拨款R01 HL076712，R01 CA157537和T32 HL091805的支持。

是一个由白血病和淋巴瘤学者奖提供支持的Qishen Pang 利益冲突披露：作者声明没有竞争的财务利益。
贡献：S.A.设计并进行研究，分析数据并撰写论文; Q. P.设计的研究，贡献了重要的新试剂，分析了数据。

参考

Amarachintha，S.，Sertorio，M.，Wilson，A.，Li，X.和Pang，Q.（2015）。范可尼贫血间充质基质细胞衍生的甘油磷脂通过Toll样受体信号传导阻碍造血干细胞分化。 / a> 干细胞 33（11）：3382-3396。
de Haan，G.和Ploemacher，R.（2002）。鹅卵石区域形成细胞检测在：造血干细胞方案。在：Klug，C.A。和Jordan，C.T。（Eds）中。 Humana Press ，Totowa 143-151。
Denning-Kendall，P.，Singha，S.，Bradley，B。和Hows，J。（2003）。人类脐带血中的鹅卵石区域形成细胞是异构的，与长期培养起始细胞不同。干细胞 21（6）：694-701。
Dominici，M.，Le Blanc，K.，Mueller，I.，Slaper-Cortenbach，I.，Marini，F.，Krause，D.，Deans，R.，Keating，A.，Prockop，D。和Horwitz， E.（2006）。确定多潜能间充质基质细胞的最低标准。国际细胞治疗协会立场声明。细胞疗法 8（4）：315-317。
Hartwell，KA，Miller，PG，Mukherjee，S.，Kahn，AR，Stewart，AL，Logan，DJ，Negri，JM，Duvet，M.，Jaras，M.，Puram，R.，Dancik，V.，Al -Thalor，F.，Kindler，T.，Tothova，Z.，Chattopadhyay，S.，Hasaka，T.，Narayan，R.，Dai，M.，Huang，C.，Shterental，S.，Chu，LP， Haydu，JE，Shieh，JH，Steensma，DP，Munoz，B.，Bittker，JA，Shamji，AF，Clemons，PA，Tolliday，NJ，Carpenter，AE，Gilliland，DG，Stern，AM，Moore，MAS，Scadden ，DT，Schreiber，SL，Ebert，BL和Golub，TR（2013）。基于小生境的筛查可鉴定白血病干细胞的小分子抑制剂。 Nat Chem Biol 9（12）：840-848。
Hu，X.，Garcia，M.，Weng，L.，Jung，X.，Murakami，J.L.，Kumar，B.，Warden，C.D。，Todorov，I和Chen，C.C。（2016）。鉴定成人造血龛的常见间充质基质祖细胞 Nat Commun 7：13095.
Keating，A。（2012）。间充质干细胞：新方向干细胞 10（6）：709-716。
Lim，M.，Pang，Y.，Ma，S.，Hao，S.，Shi，H.，Zheng，Y.，Hua，C.，Gu，X.，Yang，F.，Yuan，W。和Cheng，T。（2016）。改变骨髓间充质细胞阻碍白血病骨髓中正常造血祖细胞的生成 Leukemia 30（1）：154-162。
Ploemacher，R.E.，van der Sluijs，J.P.，Voerman，J.S。和Brons，N.H。（1989）。长期重建造血干细胞的体外极限稀释测定法鼠标中的细胞。血液 74（8）：2755-2763。
Robinson，SN，Ng，J.，Niu，T.，Yang，H.，McMannis，JD，Karandish，S.，Kaur，I.，Fu，P.，Del Angel，M.，Messinger，R.，Flagge ，F.，de Lima，M.，Decker，W.，Xing，D.，Champlin，R。和Shpall，EJ（2006）。高级体外脐血扩张与骨髓共培养后，骨髓移植 37（4）：359-366。
Schrezenmeier，H.，Jenal，M.，Herrmann，F.，Heimpel，H.和Raghavachar，A。（1996）。通过有限稀释测定法定量分析再生障碍性贫血患者的骨髓中鹅卵石区域形成细胞。 Blood 88（12）：4474-4480。
Spindler，T.J.，Tseng，A.W.，Zhou，X。和Adams，G.B.（2014）。脂肪细胞在体外增加对原始造血细胞的支持，但没有在稳态条件下在骨髓生态位中的作用。干细胞发育23（4）：434-441。
Yoshihara，H.，Arai，F.，Hosokawa，K.，Hagiwara，T.，Takubo，K.，Nakamura，Y.，Gomei，Y.，Iwasaki，H.，Matsuoka，S.，Miyamoto，K.， Miyazaki，H.，Takahashi，T。和Suda，T。（2007）。血小板生成素/ MPL信号调节造血干细胞静止和与成骨细胞生态位的相互作用细胞干细胞 1（6）：685-697。