材料和试剂

盐渍纱布球
药勺
锥形离心管（Corning，Falcon ，目录号：352097）或同等产品
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，产品目录号：34133）或同等产品
PAP笔（Abcam，产品目录号：ab2601）或同等产品
BD Totalys Slide Slide Rack（BD，产品目录号：491294）
Coverslip（Matsunami Glass，产品目录号：C024321）或同等产品
BD SurePath TM手动方法试剂盒（包括沉降室和带正电荷的载玻片）（BD，目录号：491266）
BD CytoRich TM红色防腐液（BD，目录号：491336）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，产品目录号：059-06957）或同等产品
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，产品目录号：136-09475）或同等产品
过氧化氢（Wako Pure Chemical Industries，目录号：086-07445）或同等产品
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Nichirei Biosciences，产品目录号：415223）或同等产品
WT1抗体（克隆6F-H2）（Agilent Technologies，目录号：M3561）
抗体稀释液（安捷伦科技公司，产品目录号：S3022）或等同物
N-Histofine®Simple Stain™MAX PO（MULTI）（Nichirei Biosciences，目录号：414151F）
N-Histofine DAB-3S试剂盒（Nichirei Biosciences，目录号：415192F）
Mayer's苏木精（Muto Pure Chemicals，产品目录号：30002）或同等产品
二甲苯（Wako Pure Chemical Industries，产品目录号：245-00717）或同等产品
马林醇（固定介质）（Muto Pure Chemicals，目录编号：20093）或同等产品

设备

移液器（Nichiryo，型号：Nichipet EXII）或同等产品
离心机（久保田，型号：M4000）或同等产品
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）或同等产品
显微镜（奥林巴斯，型号：BX43）或同等产品

程序

尿液收集
1. 第一天早上中流尿液标本最适合我们的方法。
2. 虽然现场中流尿液也可能有用，但我们还没有证实这种证据。
3. 在导管尿液中，WT1阳性细胞通过机械分离的尿道上皮细胞进行数字稀释。
4. 在女性样品的情况下，优选在收集尿液之前使用盐水浸泡的纱布球清洁尿道口以防止来自外阴的细胞污染。此外，在月经期间收集的样本不适合我们的方法。
细胞学标本制备（SurePathTM液基细胞学）
SurePathTM系统的基本原理是重力沉降和电气附着。简而言之，将沉降室夹紧到带正电荷的载玻片上，并加入细胞悬液。然后重力将细胞沉降到载玻片上，带正电荷的载玻片与带负电的细胞结合（图1和2）。

图1. SurePath™系统手动方法套件。 A.滑动机架和手动方法套件。 B.一个带正电荷的滑块和一个放置在机架中的沉降室。

图2. SurePath的基本原理 TM 系统 A.将样品转移到沉降室并安装在一张带正电的幻灯片上。 B.带负电的细胞通过重力沉降并与带正电荷的载玻片电结合。 C.过量的细胞与上清液一起被除去。 D. SurePath TM载玻片由13mm圆形单层涂片组成。
1. 用药匙搅拌全部尿液，使其变得均匀。
2. 将10毫升均匀的尿液分配到未经消毒的15毫升锥形试管中。
3. 在旋转式离心机中以800gxg旋转5分钟注意：离心机应该是摆动式的，而不是角型的。
4. 用吸气器或5毫升移液器滗析上清液。
5. 10毫升CytoRich Red™TM重新悬浮沉淀物。
  注意：
  1. 在肉眼血尿的情况下，仅在去除上清液后收集并固定血沉棕黄层。
  2. 尿液沉积物需要在尿液收集后3小时内由CytoRich Red TM TM 固定。
  3. 细胞在CytoRich Red中稳定3天 TM ，它们的存储时间不应超过此长度。 />
6. 将样品固定至少30分钟。
7. 在800×g的条件下离心5分钟，取出上清液。
8. 加入6毫升蒸馏水到沉淀物中，并用旋涡混合器重悬10秒。
9. 在800×g的条件下离心5分钟，取出上清液。
10. 向沉淀物中加入300μl蒸馏水，用旋涡混合器重悬10秒钟。
11. 重新悬浮后，将全部样本转移至沉降室并在载玻片上放置10分钟。
12. 倒置滑动架并丢弃上清液。
13. 用95％乙醇冲洗沉降室内部注意：不要将95％的乙醇直接涂抹在涂片上（图3）。
14. 倒置幻灯片架并丢弃95％的乙醇。
  注意：小心不要擦干污迹。
15. 再重复一次步骤B13和B14。
16. 16.取下沉降室，立即将玻片浸泡在95％乙醇中。
  注意：
  1. 用95％乙醇固定30分钟或更长时间后进行免疫染色。
  2. 细胞在95％乙醇中稳定3天，它们不应该长于此时间。
图3.步骤B13的示意图
免疫细胞化学（免疫酶染色）
1. 用95％乙醇固定后，将载玻片在含有0.3％过氧化氢的甲醇中孵育以阻断内源性酶活性（15分钟）。
  备注：
  1. 每次都需要新鲜制备过氧化氢溶液。
  2. 在任何过程中，当将载玻片移动通过溶液时，通过将载玻片浸入载玻片几次，充分混合溶液和载玻片。
2. 在一系列浓度降低的乙醇溶液（70％乙醇，50％乙醇和蒸馏水，每次1分钟）中水化幻灯片。
3. 删除幻灯片并使用Kimwipes擦拭细胞涂片周围的蒸馏水。
4. 用PAP笔围住涂片周围的区域。
  备注：
  1. 在擦干蒸馏水的部分使用PAP笔。
  2. 只有在PAP笔管线干燥后（10-20秒），才能进入下一步。
5. 用PBS冲洗载玻片（2次，每次1分钟）。
  注意：如果储存在4°C，PBS可以使用几个月。
6. 孵育细胞涂片与100μl稀释（1：1,000）WT1抗体在潮湿的室（在室温1小时）。
7. 用PBS冲洗载玻片（3次，每次1分钟）。
8. 孵育细胞涂片与3滴N-Histofine Simple Stain MAX PO（MULTI）在加湿室（在室温下30分钟）。
9. 用PBS冲洗载玻片（3次，每次1分钟）。
10. 用100μlDAB试剂孵育细胞涂片（1分钟）。
  注意：使用前立即准备DAB试剂。
11. 用蒸馏水冲洗载玻片（3次，每次1分钟）。
12. 用Mayer的苏木精制作幻灯片（持续30秒）。
13. 在流动的自来水下冲洗载玻片（5分钟）。
14. 用100％乙醇将玻片脱水（4次，每次5分钟）。
15. 将乙醇中的载玻片移入二甲苯（4次，每次5分钟）。
16. 使用安装介质将盖玻片安装到载玻片上。

数据分析

在光学显微镜下（目标为20x或40x），在总涂片领域中计数WT1阳性细胞数量。
代表性数据

尿WT1阳性细胞
尿WT1阳性细胞呈现中度到强烈的胞质阳性染色，并且对细胞核呈阴性。观察到这些细胞的形态为圆形至多边形，直径为20-50μm，细胞质澄清或空泡（图4A）。 WT1阳性细胞显示多种形态，从无核细胞到多核细胞。有时，存在WT1阳性细胞的包膜（图4B）（Ohsaki等人，2016）。
先前的研究已经报道WT1不仅存在于细胞核中，而且存在于细胞质中（Niksic等人，2004）。在我们的方法中，尿WT1阳性细胞显示细胞质阳性染色和核染色阴性的原因是我们使用醇基固定剂（CytoRich TM TM Red）。由于醇基固定剂对核表位的抗体产生较少的可重复染色（Gong等人，2004），所以WT1的核表达仅在福尔马林固定的材料中才能检测到（Skoog和Tani，2011）。

图4.尿WT1阳性细胞WT1免疫细胞化学（400x）。 A. WT1阳性细胞被嗜中性粒细胞和鳞状细胞包围。 B.铸造一个WT1阳性细胞。
尿WT1阳性细胞与肾小球疾病的相关性
在患有肾小球疾病的患者中，33个样品中发现WT1阳性细胞（50.0％，33/66）。在良性下尿路疾病患者（0％，0/45）和健康志愿者（0％，0/30）中未发现WT1阳性细胞。肾小球疾病中WT1阳性细胞的频率显着高于良性下尿路疾病（ <0.001>）和健康志愿者样品（ p <0.001>）的频率。 0.001）（Ohsaki et al。，2016）。
尿WT1阳性细胞与新月体形成之间的相关性
新月体形成患者的尿WT1阳性细胞数量明显高于无新月体形成的患者（ P = 0.007）（Fujita等，2017）。
尿WT1阳性细胞的临界值
尿WT1阳性细胞将新月体病变与无病变病灶区分的最佳临界值为5个细胞/ 10 ml（敏感性73.3％，特异性64.9％）。尿WT1阳性细胞产生0.735的AUC（Fujita等人，2017）。

食谱

PBS

9.55克PBS粉末
用蒸馏水将容量加至1000毫升
0.3％过氧化氢
1毫升30％过氧化氢
用甲醇将体积加至99 ml
WT1抗体
1μlWT1抗体

用抗体稀释液将体积加至999μl

致谢

Ohsaki博士获得日本肾脏基金会（基金编号：JKF12-3）和JSPS KAKENHI（基金编号：JP15K08382）的资助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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Fujita，T.，Sofue，T.，Moritoki，M.，Nishijima，Y.，Tokuhara，Y.，Wakisaka，H.，Kushida，Y.，Haba，R.和Ohsaki，H。（2017）。尿WT1阳性细胞作为新月体形成的非侵入性生物标志物细胞病理学 28（6）：524-530。
Gong，Y.，Symmans，W.F.，Krishnamurthy，S.，Patel，S。和Sneige，N。（2004）。乳腺癌细胞学标本中雌激素受体免疫细胞化学分析的最佳固定条件癌症 102（1）：34-40。
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Niksic，M.，Slight，J.，Sanford，J.R。，Caceres，J.F。和Hastie，N.D。（2004）。维尔姆斯肿瘤蛋白（WT1）穿梭于细胞核和细胞质之间，存在于功能性多核糖体中。 / Hum> Mol Genet 13（4）：463-471。
Ohsaki，H.，Sofue，T.，Kawakami，K.，Nishijima，Y.，Hara，T.，Matsunaga，T.，Kushida，Y.，Haba，R.，Shigematsu，Y.，Irino，S。和Norimatsu，Y.（2016）。使用SurePath TM处理的尿液细胞学检测WT1免疫酶染色有助于检测肾脏疾病。细胞病理学 27（1）：43-49。
Skoog，L。和Tani，E。（2011）。免疫细胞化学：常规细胞学中不可或缺的技术。细胞病理学 22（4）：215-229。
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