材料和试剂

RNA提取
1. 酸洗（≤106μm）（Sigma-Aldrich，目录号：G4649）的玻璃珠
2. 2毫升珠打浆管（QIAGEN，目录号：13118-400）
3. mirVANA TM miRNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM1560）
RNA-Seq文库制备
1. PCR管（Corning，Axygen，目录号：PCR-02-L-C）
2. RNA-Seq文库制备试剂盒，用于全转录组发现 - Illumina兼容（侏儒，目录号：K02421-T）
3. DNase / RNase游离水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9932）
4. Qubit TM RNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32855）
5. RNaseOUT TM重组核糖核酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10777019）
6. Qubit TM dsDNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32854）
7. 侏儒大小选择器（侏儒，目录号：R02424S）
其他材料
1. 移液管吸头（10μl，200μl，1,000μl）（Corning，Axygen®，产品目录号：TF-300-R-S，TF-200-R-S，TF-1000-R-S）
2. 1.5 ml Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363204）
3. 100％乙醇
4. 无RNA酶70％乙醇
5. 琼脂糖（Biowest，目录号：111860）
6. 50x TAE缓冲液（Sangon Biotech，目录号：B548101-0500）
7. DL2,000 DNA Marker（Takara Bio，目录号：3427A）

设备

移液器（0-10μl，10-100μl，100-1,000μl）（Eppendorf，产品目录号：k03030，k03031，k03032）
Vortex-genie TM 2（QIAGEN，型号：Vortex-Genie 2）
Fresco 17离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Fresco TM 17）。
Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，型号：Qubit 2.0）
自动热循环仪TP600（Takara Bio，型号：TP600）
MagneSphere ®技术磁性分离架（12个位置）（Promega，产品目录号：Z5342）
电泳仪（Bio-Rad Laboratories）
凝胶成像系统

软件

镰刀v1.33（Joshi和Fass，2011）
Mothur v1.33.3（Schloss et。，2009）
QIIME v1.8.0（Caporaso et。，2010）
MIPE（Zou et。，2017）

程序

注：低生物量样品（自来水，浴帘，泥滩水，叶面和人体皮肤）的样品采集，储存和运输详情请参见Yan等人所述的方法。（2017年）。关于泥滩沉积物样本，样本采集和核酸提取的细节在我们最近的工作中进行了描述（Yan et al。，2018）。

核酸提取
1. 使用mirVANA TM miRNA分离试剂盒从不适合DNase I消化的低生物量样品中提取总RNA或总核酸。优选将五个或更多个拭子合并用于核酸提取，而整片过滤膜优选被切成小块（〜0.5mm 2）用于提取。为了完全破坏微生物细胞壁，用0.7g玻璃珠和0.7ml溶解/结合缓冲液在提取前以最大速度在2ml珠子打浆管中涡旋此预处理的样品。在4℃以13,000xg离心5分钟后，将上清液转移到新的1.5ml管中并严格按照生产商的说明提取总RNA。
2. 电泳后在1％（w / v）琼脂糖凝胶中观察RNA样品以评估RNA完整性（图1）。在-80°C储存总RNA或总核酸。在制备RNA-Seq文库之前，使用Qubit 2.0荧光计上的Qubit TM RNA HS Assay Kit量化总RNA。
图1.低生物量样品的总RNA电泳M：DL2,000 DNA标记物; TW：自来水; SC;浴帘; MW：泥滩地表水; LS：叶表面; FH：人体皮肤的额头。当加载10μlRNA时，与产生非常低浓度的RNA（<2ng /μl）的样品相比，仅TW和MW显示积分的23S和16S rRNA条带。

制备RNA-Seq文库
该RNA-Seq文库制备方案由Gnomegen RNA-Seq文库制备试剂盒方案（目录号：K02421-T）修改。按照下述步骤准备RNA-Seq文库。

总RNA变性
1. 将总RNA（10-100 ng）和不含DNase / RNase的水加入0.2 ml PCR管中以制备20-μl反应体积。
2. 充分混合，并使用热循环仪程序在65℃孵育5分钟。
  孵化后立即放置在冰上，离开至少5分钟。
  注意：我们使用这一步取代原始的片段化步骤，以保持RNA的完整性，并在下一步中直接将RNA-Seq接头连接到rRNA的5'末端。 />

衔接子连接到RNA的5'末端

依次向变性的RNA中加入以下试剂，并使反应体积为40.6μl：

10倍连接缓冲液	3.6μl（最终〜0.9x）
10 mM ATP	4μl（最终〜1 mM）
连接酶混合物	1微升
连接酶补充	1微升
RNaseOUT（40 U /μl）	1μl（最终〜1U /μl）
连接增强剂混合	8微升
RNA Seq 5'适配器B	2微升

充分混合，并使用热循环仪程序在37℃孵育2小时。
孵化后将试管置于冰上。
注意：RNaseOUT是一种单独购买的试剂。单链衔接子B和RNA之间的这种特异性连接避免了DNA对社区分析的干扰。
结扎产物的纯化
将40μl连接产物转移到新的1.5 ml试管中，并严格按照制造商的说明使用Gnome Size Selector纯化产品。
在下一步中获得总体积为10-μl的纯化产品。
注：将侏儒尺寸选择器暖至室温，并在使用前完全重新悬浮尺寸选择器。准确使用推荐的音量。

用标记的随机六聚体合成cDNA的第一链。

连接产物的变性
1. 在12μl变性体积中加入1μl标记的RT引物和1μldNTP（10 mM）至纯化的连接产物中。
2. 充分混合，并使用热循环仪程序在65℃孵育5分钟。
  孵化后立即放置在冰上，离开至少5分钟。

逆转录

依次将以下试剂加入变性的连接产物中，并制成最终的20-μl反应体积：

5x第一股缓冲
4微升

100 mM DTT
2微升

RNaseOUT（40 U /μl）
1微升

逆转录酶
1微升
充分混合，并使用以下热循环仪程序来合成cDNA：
25℃12分钟;
42℃40分钟;
70°C 15分钟;
保持在4°C。
cDNA纯化
严格按照制造商的说明使用Gnome Size Selector进行纯化。为下一步获得20μl纯化的cDNA。
注：将侏儒尺寸选择器暖至室温，并在使用前完全重新悬浮尺寸选择器。准确使用推荐的音量。

PCR扩增
完整的试剂混合物含有：

纯化的单链cDNA	20微升
2x HiFi PCR Master Mix	25微升
PCR引物F	1.25微升
条形码反向引物bcX	1.25微升
DNAse / RNase free water	2.5微升

注：正向和反向引物基于RNA Seq 5'衔接子B和标签序列设计，并与标准Illumina正向和反向引物互补。因此，整个过程避免了微生物相关通用引物的利用。反向引物还含有8个核苷酸（nt）的索引序列以允许多路复用。
PCR扩增条件如下：
98℃45秒;
15个循环：98℃15秒，60℃30秒，72℃30秒;
72℃1分钟;
保持在4°C。
注意：通常，1-2μlPCR产物足以在1％琼脂糖凝胶上显示。因此，将观察到广泛的清晰和涂片条带（100-2,000bp）。

纯化PCR产物
使用Gnome Size Selector严格按照制造商的说明选择400-600碱基对（bp）PCR产物。
注：将侏儒尺寸选择器暖至室温，并在使用前完全重新悬浮尺寸选择器。准确使用推荐的音量。其他尺寸范围的PCR产物也可以根据制造商的说明使用Gnome Size Selector获得。
高通量测序
使用Qubit 2.0荧光计上的Qubit TM dsDNA HS Assay Kit对来自不同样品的条形码化PCR产物进行定量。使用2 x 300配对末端方案，将来自不同样品的PCR产物以等量（每个样品至少10 ng）和Illumina MiSeq平台上的序列混合在一起。对于每个样本，将获得格式为两个FASTQ文件的配对结束读取。

数据分析

使用命令pe，使用Sickle软件v1.33预处理配对结束读取，修剪并过滤Phred质量分数低于20的读取。
De novo 使用带有QIIME v1.8.0中的默认参数的join_paired_end.py命令合并配对结束读取。
在voth v1.33.3中使用命令fastq.info将FASTQ文件转换为fasta格式。
使用命令screen.seqs在mothur v1.33.3中移除含有模糊核苷酸和长于8个核苷酸的均聚物长度的合并序列。
使用命令screen.seqs在v1.33.3中删除短于250 bp的合并序列。
将MIPE中的SILVA SSU v119数据库的读数分类（Zou et al。，2017），启动截止值为80％，并去除鉴定为叶绿体，线粒体或人的SSU rRNA读数。还鉴定了所有细菌16S rRNA序列中引物8F（5'-AGAGTTTGAT（C / T）（A / C）TGGCTCAG-3'）的错配（Mao等人，2012）用这个软件（表1）。

表1.细菌通用引物8F的未覆盖率

通过将分类群的非覆盖序列（至少一个引物8F内的不匹配）与其相对总序列相除来计算未覆盖率。没有显示数据集中少于10个未覆盖序列的门。
TW：自来水;自来水; SC;浴帘; MW：泥滩地表水; LS：叶表面; FH：人体皮肤的额头。
对于每个样品，使用get.seqs命令提取所有鉴定的原核16S rRNA读数，并将读数存入fasta文件。在Linux中使用cat命令合并所有样本的所有fasta文件，并使用mothur v1.33.3中的count.seqs命令根据样本区分序列。
使用align.seqs和pcr.seqs命令分别在v1.33.3中对齐和修剪序列以离开8F-V1-V2区域（ E.coli 位置8至242）。
分析基于OTU的社区结构（图2）并计算MiSeq SOP管道之后的多样性指数（ https：// www。 mothur.org/wiki/MiSeq_SOP ），如Kozich等人（2013）中所述。代表性的OTU序列在0.03的截止值处分类地针对SILVA SSU v119数据库进行分类，其自引导截止值为50％。属于叶绿体或线粒体的OTUs也从分析中删除。
注：所有用于计算分析的脚本都可以在我们的补充材料“ Supplementary.docx “。

图2.不同样品中门的水平上OTU基细菌群落的比较'其他物种'包括由小分数（<1％）组成的分类群。 “未分类”包括对于细菌的50％自助截止值的序列。 TW：自来水; SC;浴帘; MW：泥滩地表水; LS：叶表面; FH：人体皮肤的额头。

笔记

所有RNA样品和反应试剂都应解冻并在冰上运行。一旦准备好反应混合物，尽快执行热循环仪程序。
对于不同的样品，PCR扩增步骤中使用的最佳循环可以使用10-μl初步反应体系来确定。

致谢

该协议是从我们以前的研究中采纳的（Yan等人，2017年）。这项工作得到了国家自然科学基金委的支持[资助号31170114]。我们声明，该研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

参考

Blazewicz，S. J.，Barnard，R. L.，Daly，R. A.和Firestone，M. K.（2013）。评估rRNA作为环境群落中微生物活动的指标：限制和用途 ISME J 7（11）：2061-2068。
Caporaso，JG，Kuczynski，J.，Stombaugh，J.，Bittinger，K.，Bushman，FD，Costello，EK，Fierer，N.，Pena，AG，Goodrich，JK，Gordon，JI，Huttley，GA，Kelley， ST，Knights，D.，Koenig，JE，Ley，RE，Lozupone，CA，McDonald，D.，Muegge，BD，Pirrung，M.，Reeder，J.，Sevinsky，JR，Turnbaugh，PJ，Walters，WA， Widmann，J.，Yatsunenko，T.，Zaneveld，J.和Knight，R。（2010）。 QIIME允许分析高通量的社区测序数据。 Nat Methods < / em> 7（5）：335-336。
Joshi，N.A。和Fass，J.N。（2011）。镰刀：适用于FastQ文件的滑动窗口，自适应，基于质量的修剪工具（版本1.33）。 < br />
Kozich，J.J.，Westcott，S.L.，Baxter，N.T。，Highlander，S.K。和Schloss，P.D。（2013）。开发用于分析MiSeq Illumina测序的扩增子序列数据的双指标测序策略和调控管线平台。 Appl Environ Microbiol 79（17）：5112-5120。
Li，X.R.，Lv，Y.，Meng，H.，Gu，J.D。和Quan，Z.X.（2014）。通过在没有PCR扩增的情况下焦磷酸测序小亚基核糖体RNA来分析微生物多样性 Appl Microbiol Biotechnol 98（8）：3777-3789。
Mao，D.P.，Zhou，Q.，Chen，C.Y。和Quan，Z.X.（2012）。使用宏基因组数据集进行通用细菌引物的覆盖率评估 12：66.
Schloss，PD，Westcott，SL，Ryabin，T.，Hall，JR，Hartmann，M.，Hollister，EB，Lesniewski，RA，Oakley，BB，Parks，DH，Robinson，CJ，Sahl，JW，Stres，B. ，Thallinger，GG，Van Horn，DJ和Weber，CF（2009）。介绍mothur：开源，独立于平台的社区支持的软件，用于描述和比较微生物群落。 Appl Environ Microbiol 75（23）：7537-7541。
Urich，T.，Lanzen，A.，Qi，J。，Huson，D.H。，Schleper，C。和Schuster，S.C。（2008）。通过分析元转录组同时评估土壤微生物群落结构和功能。 PLoS One 3（6）：e2527。
Yan，Y.W.，Jiang，Q.Y.，Wang，J.G.，Zhu，T.，Zou，B.，Qiu，Q.F。和Quan，Z.X.（2018）。使用改进的元转换方法分析泥滩沉积物中的微生物群落和多样性。 Front Microbiol 9：93。
Yan，Y.W.，Zou，B.，Zhu，T.，Hozzein，W.N。和Quan，Z.X.（2017）。修正的RNA-seq方法用于在不同类型的环境样品中使用rRNA进行微生物群落和多样性分析< / PLoS One 12（10）：e0186161。
Zou，B.，Li，J.，Zhou，Q。和Quan，Z.X.（2017）。 MIPE：基于宏基因组的社区结构探索者和SSU引物评估工具。 PLoS One 12（3）：e0174609。