材料和试剂

一次性提示
1. 10μl容量（Thermo Fisher Scientific，分子生物制品，分类号：3510-05）
2. 200μl容量（Thermo Fisher Scientific，Molecular BioProducts，目录号：3900）
3. 1毫升容量（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-502C）
100mm培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353003）
24孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
保护膜（直径13毫米;松浪玻璃，产品目录号：C013001）
1.5 ml微量离心管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-715C）
一次性血清移液器
1. 1毫升容量（Corning，Falcon ，目录号：356521）
2. 5毫升容量（Iwaki，产品目录号：7153-005）
3. 10毫升容量（Iwaki，产品目录号：7154-010）
Huh7it-1细胞（Apriyanto等人，2016）
病毒（Chen et。，2017）：
1. 丙型肝炎病毒（HCV; J6 / JFH-1株）
2. 2型登革病毒（DENV-2;特立尼达1751株）
3. 日本脑炎病毒（JEV; Nakayama株）
4. 甲型流感病毒（FLUAV; A / Udorn / 307/72 [H3N2]）
5. 仙台病毒（SeV;伏见菌株）
6. 单纯疱疹病毒1型（HSV-1; CHR3株）
7. 柯萨奇病毒B3（CV-B3;南希菌株）
碎冰
4％多聚甲醛（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-20145）
Triton X-100（Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-21105）
牛血清白蛋白（BSA; Wako Pure Chemical Industries，目录号：015-21274）
初级抗体（Chen等人，2017）：抗病毒的抗体，如HCV，DENV-2，JEV，FLUAV，SeV，HSV-1和CV-B3
二抗：
1. FITC缀合的山羊抗人IgG（MEDICAL＆amp; BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：104AG）
2. Alexa Flour488结合山羊抗小鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11001）
3. Alexa Flour488结合山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11008）
Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，目录号：H3570）
Vectashield解决方案（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
胰蛋白酶-EDTA溶液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：209-16941）
高糖Dulbecco's改良Eagle培养基（Wako Pure Chemical Industries，目录号：044-29765）
含有非必需氨基酸的MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10370-021）
胎牛血清（FBS; Biowest，目录号：S1820）
青霉素 - 链霉素溶液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-23191）
氯化钠（NaCl; Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
氯化钾（KCl; Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4·12H 2 O; Sigma-Aldrich，目录号：71649）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4; Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-04245）
柠檬酸钠脱水物（Sigma-Aldrich，目录号：W302600）
柠檬酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：030-05525）
培养基（见食谱）
不含Ca 2 +和Mg 2+（PBS [ - ]）和1x PBS（ - ）的10x磷酸盐缓冲盐水（见食谱）
柠檬酸缓冲液（见食谱）

设备

生物安全柜（，Panasonic，型号：MHE-S1301A2）
CO 2培养箱（例如，Panasonic，型号：MCO-20AIC）。
高压灭菌器（例如，TOMY SEIKO，型号：SX-500）
冷藏台式离心机（例如，Eppendorf，型号：5424）
微量移液器（Gilson，P20，P200，P1000）
血细胞计数器（例如，Erma，目录号：03-303-1）
-80°C冷冻机（，例如，PHC，型号：MDF-384）
倒置显微镜（，例如，奥林巴斯，型号：CKX53）
荧光显微镜（如，Carl Zeiss，型号：LSM700）

程序

图1和2显示了该协议的全部过程。在这个协议中，FA方法用于病毒滴定。

图1.加法时间实验。预处理：在病毒接种细胞前，用抗病毒物质处理细胞（1）或病毒（2）。共同处理：将与抗病毒物质（3）混合的病毒接种到细胞中。后处理：病毒感染的细胞（4）用抗病毒物质处理。图3显示了加法时间实验的代表性结果。

图2.用于区分病毒附着和穿透的温度转换测定。附着的阻断：在4℃用抗病毒物质处理细胞和病毒接种物（5）。渗透的阻断：在37℃用抗病毒物质处理在4℃接种病毒的细胞（6）。

图3.添加时间实验的代表性结果细胞的预处理：在病毒接种细胞前，用连续稀释的抗病毒物质处理细胞。共同处理：病毒和细胞用抗病毒物质的连续稀释液处理。后处理：病毒感染的细胞用抗病毒物质的连续稀释液处理。（ - ）：模拟处理的控制。结果显示在共处理条件下对病毒感染的剂量依赖性抑制，但不是在细胞预处理或后处理条件下。

病毒感染前对细胞进行预处理（见图1）
第1天
1. 将玻璃盖玻片放入24孔板的每个孔中并将Huh7it-1细胞（2×10 5个细胞）种到每个孔（500μl/孔）。
2. 将细胞在37℃在5％CO 2孵育器中培养过夜。
  注意：过夜培养后，细胞融合80-90％。
第2天
1. 移除每口井的培养基
2. 加入含有抗病毒物质系列稀释液（例如，<1,000,1,000,10和1ng / ml）的200μl培养基。
3. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时至24小时。
4. 为了制备病毒溶液，将病毒储液在1.5ml试管中的适当体积的培养基（例如<2,000>焦点形成单位[FFU]，200μl）中稀释并轻轻涡旋。 >
5. 取出含有抗病毒物质的培养基，用培养基冲洗细胞两次。
6. 将病毒接种到药物预处理的细胞上（感染复数[MOI] = 0.01至0.1FFU /细胞）（200μl/孔）。
  注意：在没有抗病毒物质的情况下，将病毒接种到细胞中。
7. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时
8. 去除接种物，用培养基冲洗细胞三次。
9. 加入不含抗病毒物质的培养基（500μl/孔）。
10. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
1. 从每个孔中取出培养基，用PBS（ - ）冲洗细胞两次。
2. 为了修复受感染的细胞，小心地将4％多聚甲醛加入到每个孔中的盖玻片（200μl/孔）并离开20分钟。
  注：关于细胞固定的更详细的说明已在Bio-protocol“小鼠肠干细胞的免疫荧光染色”（O'Rourke等，2016）中有所描述。
3. 用PBS（ - ）（200μl/孔）洗涤细胞三次后，加入PBS（ - ）中的0.1％Triton X-100（200μl/孔）以使细胞在室温下透化15分钟。
4. 用PBS（ - ）（200μl/孔）清洗细胞三次。
5. 用含1％BSA的PBS（ - ）（200μl/孔）培养细胞1小时，以避免非特异性FA染色。
6. 在室温下用PBS（ - ）（200μl/孔）中适当浓度的抗病毒抗体（一抗）孵育细胞1小时。
  注：作为第一抗体，我们使用兔抗DENV PrM（1：500稀释），小鼠抗DENV（1：500稀释），抗HCV人血清（1：500稀释），兔抗CV -B3（1：100稀释），兔抗FLUAV（1：1,000稀释），兔抗SeV（1：1,000稀释）和兔抗HSV-1（1：1,000稀释）。
7. 用PBS（ - ）（200μl/孔）清洗细胞3次，除去未结合的抗体。
8. 在室温下用适当来源的IgG（人类，小鼠，兔，等等）与FITC或Alexa488结合的二抗（1：800稀释，200μl/孔）孵育细胞1小时。
9. 用PBS（ - ）（200μl/孔）清洗细胞3次，除去未结合的抗体。
10. 用PBS（ - ）稀释Hoechst 33342（1：1,000稀释）反应5分钟并用PBS（ - ）（200μl/孔）冲洗三次。
11. 将少量Vectashield解决方案放在载玻片上。用镊子拿住盖玻片，并触摸边缘纸巾去除多余的PBS（ - ）。颠倒盖玻片，夹住盖玻片和玻璃杯，避免气泡。在室温下在黑暗中风干后，在荧光显微镜下观察。
  注意：水疱性口炎新泽西州病毒（VSNJV），辛德比斯病毒（SINV）和脑心肌炎病毒（EMCV）的感染性可以通过空斑试验和/或50％组织培养感染剂量（TCID50 /如其他地方所述。另外，感染细胞中的病毒蛋白和病毒核酸（DNA和/或RNA）的量可以分别通过Western印迹和定量PCR（qPCR和qRT-PCR）分析来确定。
在接种细胞前预处理病毒（见图1）
第1天
请参阅程序A的第1天。

第2天
1. 在1.5ml试管中的培养基中制备抗病毒物质（2,000,200,20和2ng / ml）的系列稀释液。
2. 要制备病毒溶液，将病毒原液稀释在1.5 ml试管中适量的培养基（2,000 FFU，100μl）中，并轻轻地涡旋。
3. 在1.5ml管中加入100μl抗病毒物质溶液和100μl病毒。
  注：抗病毒物质的最终浓度为1,000,100,10和1 ng / ml。
4. 轻轻旋转。
5. 在37°C孵育1小时注：病毒在接种细胞前先用抗病毒物质预处理1小时。
6. 移除每口井的培养基
7. 接种200μl病毒抗病毒物质混合物到细胞上（MOI = 0.01到0.1）。
8. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时
9. 移出接种物，用培养基冲洗细胞三次。
10. 加入不含抗病毒物质的培养基（500μl/孔）。
11. 将细胞在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
如上所述，参见程序A的第3天。
细胞和病毒的共同治疗（见图1）
第1天
请参阅程序A的第1天。

第2天
1. 准备在1.5毫升管中的培养基系列稀释的抗病毒物质（2,000,200,20和2毫微克/毫升）。
2. 为了制备病毒溶液，在1.5ml试管中将病毒原液稀释在适当体积的培养基（2,000 FFU，100μl）中，并轻轻地涡旋。
3. 在1.5ml管中加入100μl抗病毒物质溶液和100μl病毒。
  注意：抗病毒物质的最终浓度为1,000,100,10和1ng / ml。
4. 轻轻旋转。
5. 移除每口井的培养基
6. 接种200μl病毒抗病毒物质混合物到细胞上（MOI = 0.01到0.1）。
  注意：在病毒与抗病毒物质混合后，立即接种到细胞而不需要培养时间。
7. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时
8. 移出接种物，用培养基冲洗细胞三次。
9. 加入不含抗病毒物质的培养基（500μl/孔）。
10. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
请参阅程序A的第3天。
病毒感染细胞的后处理（见图1）
第1天
请参阅程序A的第1天。

第2天
1. 为了制备病毒溶液，在1.5ml试管中将病毒原液稀释在适当体积的培养基（2,000 FFU，100μl）中，并轻轻地涡旋。
2. 从每个孔中取出培养基。
3. 将200μl病毒接种至细胞（MOI = 0.01至0.1）。
4. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时
5. 在培养基中准备连续稀释的抗病毒物质（1,000,100,10和1 ng / ml）。
6. 去除接种的病毒，用培养基冲洗细胞三次。
7. 加入含有抗病毒物质系列稀释液的培养基（500μl/孔）。
8. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
请参阅程序A的第3天。
阻断病毒附着（温度转换测定）（见图2）
第1天
请参阅程序A的第1天。

第2天
1. 将包含细胞的24孔板置于4°C下1小时。
2. 在4°C的培养基中制备抗病毒物质（2,000,200,20和2 ng / ml）的连续稀释液。
3. 为了制备病毒溶液，在4℃在1.5ml试管中将病毒原液稀释在适当体积的培养基（2,000 FFU，100μl）中。
4. 在1 ml 1.5 ml试管中混合100μl抗病毒物质溶液和100μl病毒。
  注意：抗病毒物质的最终浓度为1,000,100,10和1ng / ml。
5. 轻轻旋转。
6. 从每个孔中取出培养基。
7. 在4℃下将200μl病毒 - 抗病毒物质混合物接种到预先冷却的细胞中。（MOI = 0.1至0.01）
  注意：在病毒与抗病毒物质混合后立即将病毒 - 抗病毒物质混合物接种到预先冷冻的细胞中。
8. 在4°C孵育1小时。
9. 取出接种物，用冷冻培养基冲洗细胞三次。
10. 添加不含抗病毒物质的培养基（500μl/孔）。
11. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
请参阅程序A的第3天。
阻断病毒穿透（温度转换测定）（见图2）
第1天
请参阅程序A的第1天。

第2天
1. 将包含细胞的24孔板置于4°C下1小时。
2. 为了制备病毒溶液，在4℃在1.5ml试管中将病毒原液稀释在适当体积的培养基（2,000 FFU，100μl）中。
3. 在4°C（MOI = 0.01至0.1）接种200μl病毒至预先冷冻的细胞中。
4. 在4°C孵育1小时
5. 在培养基中准备连续稀释的抗病毒物质（1,000,100,10和1 ng / ml）。
6. 去除病毒接种物并用冷冻培养基冲洗细胞三次。
7. 加入含有抗病毒物质系列稀释液（200μl/孔）的培养基。
8. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时
9. 去除含有抗病毒物质的培养基。
10. 用柠檬酸盐缓冲液或PBS（ - ）清洗去除未内化的病毒注：某些病毒如HCV，DENV，JEV和西尼罗河病毒通过pH介导的进入途径渗入细胞并对酸性处理敏感。当病毒接种的细胞暴露于柠檬酸盐缓冲液（pH3.0）时，病毒颗粒结合在细胞表面，但不是已经渗入细胞的病毒颗粒失活。
11. 添加不含抗病毒物质的培养基（500μl/孔）。
12. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
第3天
请参阅程序A的第3天。

数据分析

所有的实验应该至少重复三次。
每个样品的50％抑制浓度（IC 50）由四参数逻辑方程估算：
[y = D +（A-D）/ 1 +（x / C）×B;
y =响应，x =浓度，A =最小渐近线，B =斜率因子，C =对应于A和D之间中间响应的浓度，D =最大渐近线]（Sebaugh等人， 2011）。在Bio-protocol“抗病毒物质和抗体的杀病毒和中和活性测试”（Aoki-Utsubo等人，印刷中）中描述了详细的程序。
或者，将每个样品的数据绘制在S形曲线的图中，并根据Bio-protocol“抗病毒物质和抗体的杀病毒和中和活性测试”中所述的图确定IC 50，（Aoki-Utsubo 等，正在出版）。

笔记

基于免疫荧光观察结果，可以如下计算病毒滴度（FFU / ml）。
1. 在显微镜下随机选择玻璃滑块的10个区域，并计算每个区域的病毒抗原阳性细胞数量。
2. 计算病毒抗原阳性细胞的平均数量（称为焦点）。
3. FFU / ml是病毒抗原阳性细胞的平均数×面积换算系数×稀释因子×体积因子（ml）。
  注意：面积换算系数基于通过显微镜对抗24孔板中孔的区域的场地面积。
在每个测定中，准备用抗病毒物质处理或模拟处理的阳性和阴性对照。作为阳性对照，细胞可以用阻断病毒生命周期特定步骤的抑制剂（例如，肝素作为HCV进入抑制剂，环孢菌素作为HCV复制抑制剂）处理。模拟处理的阴性对照样品是用含有DMSO的培养基或稀释剂处理的感染细胞。
测试样品对病毒感染的抑制百分比可以通过分别与用模拟处理的对照获得的数据进行比较来计算。

食谱

培养基
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
1个非必需氨基酸
10％胎牛血清（FBS;在56℃热灭活30分钟）
100U / ml青霉素和链霉素
不含Ca 2+和Mg 2+（PBS [ - ]）和1x PBS（ - ）的10x磷酸盐缓冲盐水
1. 溶解NaCl（80g），KCl（2g），Na 2 HPO 4·12H 2 O（28.8g）和KH 2 （2.4克）在800毫升dH 2 O中的溶液
2. 使用dH 2 O
  将音量调节至1 L
3. 在121°C高压灭菌20分钟
4. 用蒸馏水稀释至1x
柠檬酸盐缓冲液（50mM柠檬酸钠，4mM KCl，pH3.0）
1. 准备100毫克柠檬酸一水合物（21克/升：柠檬酸）
2. 将柠檬酸钠脱水物（1.47g）和KCl（29.82mg）溶于适当体积的dH 2 O（<100ml）中。
3. 使用100 mM柠檬酸调节pH值
4. 用dH 2 O 0填充至100毫升
5. 在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在室温下

致谢

这项工作得到了日本厚生劳动省病毒性肝炎研究和日本医学研究与开发署（AMED）的资助。这项工作也得到了东京都政府特别研究登革热疫苗开发援助的部分支持。该协议是根据Chen等人发表的程序改编的。作者没有任何利益冲突或利益冲突声明。

参考

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