材料和试剂

移液器吸头
1.5毫升管
2毫升管
10毫升试管
Millipore过滤器，0.22μm（Millex-GP，Merck，目录号：SLGP033RB）
酵母YTK12株
pSUC2载体
Eco RI限制性酶（Takara Bio，目录号：1040S）
XhoI限制酶（Takara Bio，目录号：1094S）
10.酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
蛋白胨（BD，Difco TM，产品目录号：211677）
葡萄糖（国药集团化学试剂，目录号：10010518）
琼脂A（Sangon Biotech，产品目录号：A600010）
腺嘌呤半硫酸盐（Sigma-Aldrich，Vetec，目录号：V900375）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：V900312）
EDTA（国药集团化学试剂，目录号：10009617）
NaOH（国药集团化学试剂，目录号：10019718）
单链载体DNA（鲑鱼精子DNA，Solarbio，目录号：D8030）
LiAc（国药集团化学试剂，目录号：30109760）
PEG（聚乙二醇，Sigma-Aldrich，目录号：P3640）
DMSO（二甲基亚砜，Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
YNB（不含氨基酸的酵母氮源，BD，Difco TM，目录号：291920）
-Trp DO补充剂（Clontech，目录号：630413）
蔗糖（国药集团化学试剂，目录号：10021418）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
棉子糖（D - （+） - 棉子糖五水合物，Bomei，CAS编号：17629-30-0）
醋酸钠（国药集团化学试剂，目录号：10018718）
醋酸（国药集团化学试剂，目录号：10000218）
KH 2 PO 4（国药集团化学试剂，目录号：10017618）
Na 2 HPO 4（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10020318）
TTC（东京化学工业（TCI），CAS编号：298-96-4）
YPD培养基（1L）（见食谱）
1×TE缓冲液（100毫升）（见食谱）
单链载体DNA（2 mg / ml）（见食谱）
1.0 M LiAc（100毫升）（见食谱）
50％（w / v）PEG（100 ml）（见食谱）
CMD-W培养基（1L）（见食谱）
抗霉素A储备液（50毫克/毫升）（见食谱）
YPRAA培养基（1 L）（见食谱）
10 mM乙酸 - 醋酸钠缓冲液（100 ml，pH = 4.7）（见食谱）
磷酸盐缓冲液（150毫升）（见食谱）
TTC库存解决方案（2％）（请参阅食谱）

设备

移液器（梅特勒 - 托利多国际，RAININ，型号：XLS）
孵化器（ZHICHENG，型号：ZXDP-B2050）
洁净工作台（AIRTECH，型号：SW-CJ-2FD，产品目录号：A11062689）
水浴（上海景洪实验仪器，型号：DK-8D）
涡旋混合器（Kylin-Bell Lab Instruments，型号：VORTEX-5）
孵化器摇床（常州紫葆瑞仪器制造有限公司，型号：THZ-D）
离心机（Eppendorf，型号：5424）

程序

pSUC2载体构建
1. 将编码预测的信号肽和随后的另外两个氨基酸的DNA片段扩增并使用EcoRI和XhoI限制性位点（图1）引入pSUC2中。
  切酶位点周围的DNA序列如下，位点序列加下划线。
  Eco EcoRI：5'TCCAAGCTCGGAATTTTAATTAAGAATTC 3'
  Xho I：5'CTCGAGGTTCTCCCTATAGTGAGTCGTAT 3'
  
  图1. pSUC2的矢量信息该图由Jacobs（Jacobs et al。，1997>）进行了修改。
2. 如下通过PCR用pSUC2载体特异性引物确认阳性转化体，其应通过测序进一步确认。
  pSUC2F：GGTGTGAAGTGGACCAAAGGTCTA
  pSUC2R：CCTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTT
3. 在本研究中，我们使用含有来自大豆疫霉（Phytophthora sojae）的Avr1b信号肽的重组质粒，该质粒被证明是功能性的（Dou等人，2008; Song等人，2015）。
质粒DNA转化酵母细胞
1. 将YPDA琼脂平板与来自冷冻酵母原液的YTK12酵母细胞划线接种，在30℃下将平板颠倒孵育2-3天直至菌落出现。
  注意：YPD培养基也可以使用，尽管酵母可以在YPDA上获得更好的状态。如果没有特殊说明，则在室温下进行以下步骤。
2. 在无菌试管中将一个菌落（直径2-3mm）接种到3ml YPDA液体培养基中，在30℃下以220rpm振荡孵育16-18小时，并在600nm处测量OD值以获得具有OD的悬浮液值大于0.6（OD <600> 0.6）。
3. 吸取约1.5毫升细胞悬液到2毫升试管中，并在室温下以12,000×gg离心1分钟。
4. 丢弃上清液并用1.5 ml无菌蒸馏水或TE缓冲液重新悬浮细胞。
5. 将细胞以12,000×g离心1分钟并丢弃上清液。
6. 对于每次转化，按如下顺序将试剂加入2ml试管中并保持在冰上：34μl质粒DNA和无菌水（1μg质粒DNA将足以转化）; 50μl单链载体DNA（2.0mg / ml）并充分混合; 36μl1.0M LiAc并充分混合; 240μl50％（w / v）PEG 3350并涡旋混合，或使用无菌枪头打碎细胞沉淀以彻底混匀。
7. 在30°C以220转/分的速度摇动30分钟
8. 加入1/10体积DMSO并轻轻混合。
9. 在42℃孵育细胞悬液15分钟，并在此期间颠倒混合数次。
10. 在冰上孵育2分钟。
11. 在12,000×gg下离心1分钟并丢弃上清液。
12. 加入100μl无菌蒸馏水或TE缓冲液，并用移液管小心重新悬浮细胞。
13. 使用无菌玻璃棒将细胞悬液涂布在选择性培养基CMD-W平板上，并在30℃孵育3天。
在选择性培养基上筛选阳性酵母菌落
1. 转化后，将酵母细胞铺在CMD-W培养基平板上。
2. 将菌落划线到新鲜的CMD-W平板上，并在30°C孵育至少2天。
3. 将菌落划线至新的CMD-W平板和YPRAA平板（棉子糖培养基）并在30℃孵育2-3天。
颜色观察来检测信号肽分泌功能
1. 颜色变化用于检测信号肽分泌功能。
2. 将单一转化菌落划入CMD-W液体培养基中，将不含任何质粒DNA的YTK12酵母培养于YPDA液体培养基中作为对照。
3. 在220°C振荡培养36小时，30°C。
4. 吸取约1.5毫升细胞悬液到2毫升试管中，并在室温下以12,000×gg离心1分钟。
5. 丢弃上清液，加入1.5毫升无菌蒸馏水和涡流震荡混合剧烈。
6. 在12,000×gg下离心1分钟，弃去上清液并加入1.5ml无菌蒸馏水并涡流震荡以充分混合。
7. 12,000×g g离心1分钟，弃去上清液。
8. 重悬于750μl无菌蒸馏水中，加入250μl10 mM乙酸 - 醋酸钠缓冲液（pH = 4.7），500μl10％蔗糖溶液（w / v），37°C孵育10 min。 />
9. 在12,000×gg下离心1分钟，取100μl上清液，放入玻璃试管并加入900μl0.1％TTC溶液，在室温下孵育5分钟。如果信号肽具有功能，则会观察到比色变化，而YTK12菌株和携带空pSUC2载体的YTK12则不会观察到红色。＆nbsp;
  注：空的pSUC2载体也包含一个非功能性序列。

数据分析

如果信号肽是功能性的，酵母转化体可以在CMD-W和YPRAA培养基平板上生长，并且在颜色测试实验中溶液会变成红色（图2）。

图2.Avr1b的信号肽的功能验证携带在pSUC2载体中融合的Avr1b信号肽片段的酵母YTK12菌株能够在CMD-W和YPRAA培养基中生长，并且还诱导红色反应，表明分泌功能。携带空pSUC2载体的YTK12菌株和YTK12用作对照。

笔记

在CMD-W平板上接种菌落是为了验证质粒DNA是否转化到酵母中。我们还观察到，在长时间孵育（超过三天）的条件下，没有任何载体的酵母可以在CMD-W和YPRAA平板上获得少量的生长。为了测定转化酶分泌，将菌落铺在含有棉子糖但缺少葡萄糖的YPRAA板上数次。如果孵育超过三天，含有pSUC2载体的转化体可以在YPRAA平板上生长。因此，当酵母菌落在CMD-W和YPRAA平板上划线时，必须每天观察。颜色变化的原理是通过将2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）还原为不溶性红色1,3,5-三苯甲forma（TPF）来检测转化酶的酶活性。

食谱

YPD培养基（1升）
10克酵母提取物
20克蛋白胨
20克葡萄糖
将蒸馏水加入1L，在121℃高压灭菌15分钟。
添加20克琼脂A固体培养基
在YPD中补充30mg / L的腺嘌呤半硫酸盐可以为酵母提供更好的生长条件
1x TE缓冲液（100 ml）
1M Tris-HCl（pH 7.5）10ml
500 mM EDTA（pH 8.0）2 ml
用NaOH调节pH至7.5
弥补100毫升

在121°C高压灭菌15分钟
单链载体DNA（2mg / ml）
1. 通过在4℃下使用磁力搅拌将100mg单链载体DNA溶解于50ml无菌TE缓冲液中，直至看不到可见的DNA。
2. 将1.0毫升样品分配到1.5毫升试管中，并将载体DNA在沸水浴中变性5分钟，立即在冰/水浴中冷却几分钟，并储存在-20℃。
3. 每次使用时，请务必在冰上逐渐融化变性的载体DNA
4. 变性的载体DNA可以煮沸，冷冻和解冻多次
1.0 M LiAc（100毫升）
10.2克LiAc
加蒸馏水至100毫升体积
通过过滤Millipore过滤器单元进行消毒，0.22μm
50％（w / v）PEG（100 ml）
50克PEG
加入80毫升蒸馏水使其完全溶解，然后使体积达到100毫升

在121°C高压灭菌15分钟
CMD-W培养基（1L）
6.7克YNB（不含氨基酸的酵母氮基）
0.74克-Trp补充剂
20克蔗糖
1克葡萄糖
20克琼脂A
将蒸馏水加入1L，在121℃高压灭菌15分钟。
抗霉素A储备液（50毫克/毫升）
将50mg抗霉素A溶于DMSO（二甲基亚砜）中
YPRAA中（1升）
10克酵母提取物
20克蛋白胨
20克棉子糖
20克琼脂A
将蒸馏水加入1L，在121℃高压灭菌15分钟。

在即将浇注中型平板之前加入抗霉素A至最终浓度为2 mg / ml
10mM乙酸 - 乙酸钠缓冲液（100ml，pH = 4.6）
0.136克醋酸钠
加90毫升水

用醋酸将pH调至7.5 弥补100毫升
磷酸盐缓冲液（150毫升）
100毫升66.7毫摩尔KH 2 PO 4水溶液 50毫升68.6毫米
充分混合即可得到磷酸盐缓冲液
TTC库存解决方案（2％）
1. 将2克TTC溶于100毫升水中，存放于棕色瓶中或远离光线
  注意：由于水中的TTC不能长期保存，因此应将其溶解在磷酸盐缓冲液中进行长期保存。
2. 用1M NaOH稀释至0.1％

致谢

本研究得到国家自然科学基金（批准号：31701736）和中央高校基础研究基金（批准号：2662015PY195和2662017JC003）的资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Gietz，R.D。和Schiestl，R.H。（2007）。使用LiAc / SS载体DNA / PEG方法进行大规模高效酵母转化。 a> Protoc 2（1）：38-41。
Jacobs，KA，Collins-Racie，LA，Colbert，M.，Duckett，M.，Golden-Fleet，M.，Kelleher，K.，Kriz，R.，LaVallie，ER，Merberg，D.，Spaulding，V. ，Stover，J.，Williamson，MJ和McCoy，JM（1997）。分离编码分泌蛋白的cDNA的遗传选择。 Gene > 198（1-2）：289-296。
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