材料和试剂

Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）甲硫氨酸和不含半胱氨酸的培养基（1x）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：21013-024）
透析胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：26400-036）
Express S蛋白标记混合物（PerkinElmer，目录号：NEG 0720008MC）
电池升降器（Corning Incorporated，目录号：3008）
蛋白A琼脂糖（Zymed，目录号：10-1042）
p53 DO-1（Santa Cruz，目录号：SC-126）
DC蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0116）
Bio-Rad安全染色溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0786）
L-谷氨酰胺或Glutamax（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：35050-061）
cOmplete Ultra片剂（Roche Applied Science，目录号：05 892 988 001）
PhosSTOP片剂（Roche Applied Science，目录号：049068450001）
NP-40（IGEPAL，目录号：CA-630）
β巯基乙醇
溴酚蓝
完成媒体（见配方）
饥饿媒体（请参阅食谱）
Dulbecco的PBS（参见食谱）
1x裂解缓冲液（见配方）
2x SLB缓冲液（见配方）
洗涤的蛋白A琼脂糖（见配方）

设备

Bioruptor超声波仪（Diagenode）
Macsmix管旋转器（Miltenyi Biotech GmbH）或标准旋转轮
热块
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）运行设备
轨道振动器
3毫米whatman纸和塑料包装
凝胶干燥器和泵
储存荧光屏（Molecular Dynamics）和Typhoon Trio（GE Healthcare）

软件

图像定量软件（Molecular Dynamics）

程序

标签
1. 在收获前48小时，将细胞以350,000/100mm平板接种在完全培养基中（这将是细胞类型依赖性的，目标是在收获日70％汇合）。
2. 吸出培养基，并用室温（RT）PBS（10ml/100mm板）轻轻洗涤细胞
3. 取出PBS，并更换为温热（37°C）饥饿培养基（每100 mm平板6 ml）
4. 将细胞返回培养箱1小时。
5. 将200μCi的Express ³⁵ S蛋白标记混合物（每个培养皿18μl）直接加入培养基并旋转。
6. 返回孵育器30分钟。
7. 或者：
  1. 收获（0小时）
  2. 或取出介质，用5毫升温热的完全培养基洗涤板两次
  3. 在收获前，将指定的时间（15分钟，30分钟，45分钟，60分钟）添加完整培养基并将培养板放回培养箱。
收获（保持样品始终冷）
1. 将板放在冰上，取出介质。
2. 用5ml冰冷的PBS轻轻洗涤平板两次，然后将平板排在其侧面，并除去任何残留的PBS
3. 加入500μl含0.5％NP-40的裂解缓冲液，并用细胞提取器报废
4. 将pippette裂解物倒入1.5ml Eppendorf管中
5. 超声处理裂解液5分钟，周期为30秒，然后使用Bioruptor在4℃下30秒关闭。
6. 在4℃下，以11,000×g /分钟旋转样品10分钟
7. 将上清转移到新管中，使其保持在冰上
8. 使用DC Bio-Rad测定根据制造商说明书使用BSA作为对照确定样品的蛋白质浓度。样品一式三份进行测定
p53免疫沉淀
1. 将等量的蛋白质加入每个管中，并用裂解缓冲液补足至400μl的最终体积
2. 向每个样品中加入40μl洗涤的蛋白A琼脂糖凝胶以预清洗样品。
  注意：珠子在50％浆液中，因此最终床体积为20μl; 使用具有最后20％截止端的尖端产生较大的孔径，向上和向下移动吸头至少5次，以确保珠子不会粘在尖端中。
3. 在4℃下在轮上旋转样品1小时。
4. 在4℃下在800×g下旋转样品2分钟
5. 转移上清液到新鲜管和：
  1. 取出20μl，保持为"输入"加载控制目的
  2. 加入40μl50％的洗涤的蛋白A琼脂糖凝胶与0.3μgp53或对照抗体的浆液
6. 在4℃下翻滚过夜。
7. 在4℃下以800×g离心2分钟。
8. 取出上清液，用600μl含有0.1％NP-40的裂解缓冲液洗涤珠子三次（轻弹管重悬的珠子不吸取它们）。
9. 在4℃下在800×g下旋转样品2分钟
10. 除去上清液，用1ml没有NP-40的裂解缓冲液洗珠子两次以上
11. 在4℃下在800×g下旋转样品2分钟
12. 取出所有上清液，加入40μl2.5x SLB缓冲液
13. 在95℃下在加热块中煮沸10分钟
14. 在冰上冷却5分钟。
15. 在加热块中再煮沸5分钟。
16. 以最大速度脉冲旋转30秒。
17. 将上清转移到新试管中（〜50μl/样品）
18. 在具有4％堆叠器，1.5mm厚，10孔梳子的10％PAG上的负载输入，免疫沉淀和标记，然后在100V下运行凝胶约2小时（当染料几乎在凝胶底部时停止） br />
19. 从板上除去凝胶并用ddH 2 O洗涤凝胶两次
20. 将凝胶在Bio-Rad安全染色溶液中染色1小时，同时在轨道摇床上轻轻旋转
21. 更换染色剂，并在轨道摇床上轻轻旋转的同时孵育20分钟
22. 从染色中除去凝胶，并放入新鲜的容器中，然后加水脱色，在1小时内将水重新洗2-4次
23. 小心地将凝胶放置在两层3mm的纸上，盖上快速包装，使用Bio-Rad凝胶干燥器在80℃下干燥〜2小时（直到不再粘稠）。
24. 通过phosphoimager屏幕放置凝胶过夜，然后用台风三重奏分析
25. 使用Image Quant软件（Molecular Dynamics）对带进行定量。

食谱

填写媒体
1x DMEM
10％FBS
1x Glutamax
饥饿媒体
甲硫氨酸和半胱氨酸游离DMEM
15％透析FBS
1x Glutamax
Dulbecco's PBS（1L）
0.2克KCl
0.2g KH 2 PO 4 sub/
2.3g Na 2 HPO 4
8克NaCl
1x裂解缓冲液
使用储备溶液制备以下最终浓度
50mM Tris（pH8.0） 150mM NaCl 5 mM EDTA
1x完全（蛋白酶抑制剂）
1x PhosphoSTOP
加入0.5％或0.1％NP-40（v/v）：使用NP-40的10％储备液向缓冲液中加入新鲜，保持冷却以帮助重悬NP-40（IGEPAL CA-630）
2x SLB
500mM Tris（pH6.8）
20％SDS
20％β-巯基乙醇 0.1％溴酚蓝
洗涤的蛋白A琼脂糖
将蛋白A琼脂糖储存在需要除去的乙醇中。
1. 删除实验所需的2.5倍体积
2. 脉冲旋转在4°C（让离心机达到最大速度，然后停止）
3. 除去上清液，加入6倍体积的裂解缓冲液加0.5％NP-40的体积为5倍
4. 重复脉冲旋转并重复洗涤
5. 除去上清液，加入在6a）裂解缓冲液中的0.5倍体积以产生50％浆料

致谢

该协议最初以Astle等人的简要版本发布。（2012）。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）向RDH（NHMRC Nos.166908和251688）和RBP（NHMRC Nos.509087和400116）以及从维多利亚癌症委员会到RBP的资助。 RDH和RBP是NHMRC高级研究员。我们承认维多利亚功能基因组学中心使用设备和建议。我们感谢Stephen Jane和Loretta Cerruti教授协助进行逆转录病毒生产。

参考文献

Astle，M.V.，Hannan，K.M.，Ng，P.Y.，Lee，R.S.，George，A.J.，Hsu，A.K.，Haupt，Y.，Hannan，R.D.and Pearson，R.B。（2012）。 AKT在缺乏DNA损伤的情况下通过mTORC1和p53诱导人类细胞衰老：对mTOR靶向的影响在恶性肿瘤期间。癌基因 31（15）：1949-1962。