材料和试剂

手套（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：19-130-1597C）
无菌牙签（Royal Paper Products，Inc.，产品编号：R820）
Ampac 500系列SealPAK耐用袋（10.2 x 15.2 cm）（Fisher Scientific，产品目录号：01-812-25D）（使用彩色标签胶带密封蛋白质印迹膜，CDP-Star或ECL主要试剂在小袋中）
制造商：Ampac，产品目录号：50024。
无菌环（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：22-363-599）
Fernbach瓶（2.8 L，宽口）（Corning，PYREX®，<目录号：4420-2XL）
挡板培养瓶（250ml）（DWK Life Sciences，Kimble，目录号：25630-250）
铝箔（Fisherbrand，Fisher Scientific，产品目录号：01-213-105）（用于包装高压灭菌的物品）
无菌聚苯乙烯一次性血清学10毫升带放大镜条纹的移液管（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：13-678-11E）
聚丙烯圆底离心管，50ml（Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3119-0050，产品编号：UX-06327-47）
用无表面活性剂醋酸纤维素（SFCA）膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：290-3320）的Nalgene快速流动无菌一次性瓶顶部0.2μm过滤器
HisTrap HP柱（5毫升）（GE Healthcare，目录号：17524802）
StrepTrap HP柱（1 ml）（GE Healthcare，目录号：29048653）
13×100mm 2培养管（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
具有平端（13×100mm）的硼硅酸盐玻璃管（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：14-961-27）（用于细胞培养）
具有Ultracel-3膜（NMWL 3 kDa）的Amicon Ultra-4离心过滤装置（Merck，目录号：UFC800308）
Superdex 75 10/300 GL柱（GE Healthcare，目录号：17517401）
无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜注射过滤器（28mm膜，孔径为0.2,0.45和0.8μm，丙烯酸外壳）（Corning，目录号：431219,431220和431221）
SnakeSkin透析管（3.5K MWCO，22mm I.D.）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：68035）。
1.5ml微量离心管（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：02-681-320）
2.0 ml微量离心管（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：02-681-321）
Zeba Spin脱盐柱（7K MWCO）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：89882）
Amersham Hybond P 0.45聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
一次性塑料比色皿（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：149-551-27）
X光胶片（RPI，目录号：248300）
Rack LTS提示（'P20'2-20μl，'P200'20-200μl，'P1000'100-1,000μl）（Mettler-Toledo，Rainin，产品目录号：17001865,17001863和17001864）
10毫升Luer-Lok注射器（BD，目录号：309695）
Kimwipes精致任务雨刷，1层（KWCC，Kimberly-Clark，目录编号：34155）
彩色标签胶带，彩虹包（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：15-901-10R）
四个正方形盒（8×10“）（Fisher Scientific，目录号：FBXC-810）（用于Western印迹膜暴露于X射线胶片）
玻璃储存/介质瓶（DWK Life Sciences，Kimble，产品目录号：14395-500为500毫升，14395-1000为1,000毫升）
聚丙烯格里芬低型塑料烧杯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：1201-4000,2000毫升和1201-1000,1000毫升）
聚乙烯包装薄膜（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：15-610）（可存储包裹在Kimwipes中的SDS-PAGE凝胶，用去离子水润湿并在电泳前在4°C进一步用聚乙烯薄膜包裹长达2周）
聚苯乙烯比色皿（1.5ml容量）（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：14-955-127）（用于可见光谱范围，340-750nm的测定）
聚丙烯塑料量筒（Nalgene，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3664-0050,3664-0250和3664-1000）
聚丙烯瓶盖（DWK Life Sciences，Kimble，产品目录号：73660-13）（与13 mm O.D.平端培养管一起使用）
带有清洁盖子的培养皿（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
细胞
1. 携带质粒pJAM3010（编码msrA-strepII质粒的质粒，该质粒在P2N1质粒的控制下）的Haloferax volcanii LR03（Δsamp1Δsamp2Δsamp3ΔmsrAΔubaA），（Fu等人，2017）或pJAM1209（一种编码他的6-tubA基因的质粒）在组成型启动子（Hepowit等人，2016）的控制下）或不携带任何质粒。
  注：H. volcanii菌株和质粒可根据要求提供。
2. 携带质粒pJAM3200（在T7启动子控制下的编码msrA-strepII的质粒）的大肠杆菌Rosetta（DE3）（Novagen，Merck，目录号：70954-3） Maupin-Furlow实验室（Fu等人，2017）或质粒pJAM1132（在T7控制下编码flag-his6-samp2的质粒）启动子）来自Maupin-Furlow实验室（Hepowit et al。，2016）
  注意：质粒可以从Maupin-Furlow实验室索取。
MsrA-StrepII（根据下文概述的步骤纯化）
His 6 -UbaA（按照下面概述的步骤纯化）
去离子H 2 O（详情请参阅设备编号22）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
新生霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N1628）
硫酸卡那霉素（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP906-5）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP1620-1）
-Desthiobiotin（Sigma-Aldrich，目录号：D1411-500MG）
咪唑，ACS试剂，≥99％滴定（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
考马斯亮蓝R-250（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610436）
Pierce Bicinchoninic acid（BCA）蛋白质分析（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：23225）
白蛋白，牛（BSA）（冻干粉，通过琼脂糖凝胶电泳纯度≥96％）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：M35-12）
硼替佐米蛋白酶体抑制剂（游离碱，纯度> 99％）（LC Laboratories，目录号：B-1408）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：D4263-1VL），含有≥0.27mg总蛋白的含有2000个Kunitz单位的DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：D4527）的标准化小瓶
二甲基甲酰胺（DMF）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP1160-500）
氯化钠（NaCl）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：S642-12）
腺苷5'-三磷酸（ATP），二钠盐水合物，98％（ACROS Organics，目录号：102800100）
二甲基亚砜（DMSO），分子生物学级（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-50ML）（用于体外试验）
DMSO，ACS认证（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：D128-1）（用于培养细胞）
二硫苏糖醇（DTT）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP172-5）
抗体
1. 链霉亲和素II单克隆抗体（小鼠）（QIAGEN，目录号：34850）
2. 抗His IgG2单克隆抗体（小鼠）（GE Healthcare，目录号：27471001）
3. HRP缀合的His 6单克隆抗体（Proteintech，目录号：HRP-66005）（抗His 6抗体替换上面列出的停用的GE Healthcare产品）。
4. 山羊抗小鼠IgG（整个分子） - 碱性磷酸酶连接的抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5153-1ML）
5. 连接碱性磷酸酶的抗Flag M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A9469-2MG）
脱脂奶粉（速溶，粉状）（Publix，莱克兰，佛罗里达州项目）
Tropix CDP-Star化学发光底物（12.5mM浓缩物）（Applied BioSystems，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：T2304）
完整的His标签纯化树脂（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：5893682001）
磷酸二氢钠一水合物（H 2 O·NaO·4P·H 2 O）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：S369-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：P285-500）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
SYPRO Ruby蛋白质凝胶染色剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703125）
生物安全的考马斯染色剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610786）
硫酸钾（K 2 SO 4）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：P304-3）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：C79-500）
细菌脱水培养基添加剂：胰蛋白胨（BD，Bacto TM，目录号：211705）
BBL脱水培养基添加剂：酵母提取物（BD，BBL TM，目录号：211929）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002）
Tris-碱（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
浓HCl（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：A481-212）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1,40％）（电泳级）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP1410-1）
四甲基乙二胺（TEMED，电泳级）（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP150-100）
过硫酸铵（APS）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610700）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）水合物（ACROS Organics，目录号：172595000）
甲醇（Fisher Chemical，Fisher Scientific，目录号：A413-4）
吐温20（分子生物学等级）（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
甘氨酸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610718）
Amersham ECL Prime Western印迹检测试剂（ECL Prime）（GE Healthcare，目录号：RPN2232）
精确加蛋白双色标准品（500μl）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610374）
ATCC974培养基（见配方1）
LB培养基（见方案2）
用于HisTrap HP色谱的裂解缓冲液（见第3部分）
用于StrepTrap HP色谱的裂解缓冲液（见配方4）
Tris-盐缓冲液（见方法5）
浓缩的分析缓冲液（见第6部分）
2x SDS还原缓冲液（见第7部分）
12％SDS-PAGE凝胶（见方法8）
10倍的运行缓冲区（见第9章）
Transblot缓冲区（见第10节）
10倍TBS（见11配方）
含有0.1％吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水（参见配方12）

设备

Sorvall Evolution RC离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall Evolution RC，目录号：728211）（用于在4至15℃下离心样品并且≤12,000xg）
Fiberlite F9-4x 1000y固定角超速转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：76981）和Sorvall SS-34固定角转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM TM-目录号：28020）（与Sorvall Evolution RC一起分别用于离心1L培养物和50ml细胞提取物）
法国新闻G-M（Glen Mills，型号：Model 11，目录号：5500-000011）（用于细胞在20,000到24,000 psi的裂解）
French Press标准压力传感器（35 ml，40,000 psi）（Glen Mills，产品目录号：6800-FA-032）（与French Press，第8项一起使用）
Sorvall RC-3通用型离心机（Newton，CT）（用于在4°C和4,000 x的HL-8摆动斗式转子的离心过滤）
水浴（LAUDA-Brinkmann，型号：LAUDA Aqualine AL 12，目录号：L000610）（用于在45°C孵育反应）
两台台式微型离心机（Eppendorf，型号：5418，目录编号：022620304）（用于离心1-2,000ml样品，最高10,000μgxg）（将一台离心机置于冷藏室中4°C，另一个在台式室温下）
BenchRocker 2D摇杆（碱性科学，目录号：RS7235）
高压灭菌器（统一灭菌器系统，型号：SR-24C）
Mini-PROTEAN Tetra Handcast System（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658005）
SmartSpec 3000 Plus分光光度计（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702525）（用于562nm处的BCA测定和监测OD 600的生长）。
PowerPac Basic 300 V电源（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：1645050）（用于在20 V下进行transblot过夜并在150 V下进行SDS-PAGE达90分钟）
新不伦瑞克I24摇床，3/4“轨道（7-60℃）（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：I24，目录号：M1344-0000）（用于在37至42°C，200 rpm）
冰箱（4°C）（Frigidare，型号：FRU17B2JW）
Puffer Hubbard（-20°C）（Revco Tech，型号：1UF1821A14）
超低温冰箱（-80℃）（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：C660-86）
XP系列顶部平衡（丹佛仪器，型号：XP-600）
分析天平（Mettler Toledo，型号：B余额线，AB54）
涡旋混合器（Thermolyne，目录号：37600）
化学通风橱（圣查尔斯制造，伊利诺伊州圣查尔斯）
移液器（2-20μl，20-200μl，100-1,000μl）（Rainin LTS）
pH计（Corning，型号：320型）（用于滴定缓冲液至pH6.8至8.8）
扫描仪（Epson Perfection，型号：3170照片）（用于扫描曝光的X光胶片和考马斯蓝R250染色蛋白凝胶，分辨率300-600dpi）
迷你转印模块（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703935EDU）
柯尼卡X光胶片处理器（Konishiroku Photo Industry，型号：QX60A）
电泳系统放射自显影盒（Fisher Scientific，目录号：FBXC-810）
西门子Vantage反渗透系统（西门子，型号：M21系列，型号：M21R004EA）带有EVOQUA过滤器（西门子，目录号：C1207098）和大西洋紫外线杀菌紫外设备（大西洋紫外线，型号：MP49）（使用水净化系统产生去离子水）
BioLogic DuoFlow 10系统（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：7600037）（用于0.5至1.2 ml·min -1的梯度梯度的蛋白质层析和通过A < sub> 280 ）
使用磁力搅拌棒（八角磁性搅拌棒试剂盒）（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：14-513-82）使用的搅拌热板（PC-220 Pyroceram）（Corning，目录号：6795-220）

程序

纯化蛋白进行体外重构测定
1. 准备 H。用于如下的MsrA-StrepII和His6-UbaA纯化。
  1. 使用无菌牙签，条纹。将来自-80℃甘油储备液的火山灰-RL3-pJAM3010（MsrA-StrepII）和LR03-pJAM1209（His6-UbaA）置于含有新生霉素（ATCC974）的琼脂板上（0.2μg·ml -1）（ATCC + Nv培养基，方案1）。库存由在具有15％（v / v）甘油的ATCC + Nv培养基中冷冻的固定相细胞组成。
  2. 在42°C的温度下将塑料拉链锁袋中的培养板培养5天，直到出现分离的菌落。
  3. 使用无菌环，将分离的菌落从平板转移至4×25ml ATCC + Nv培养基（在250ml带有箔的覆盖有挡板的培养瓶中）。将细胞在42℃下以200rpm的转速振荡生长至对数生长期（OD <600> 0.6-0.8）。
  4. 转移日志阶段 Hfx。 volcanii 细胞培养至新鲜的4×1-L ATCC + Nv培养基（在覆盖箔的2.8-Fernbach瓶中）。在42℃下以200rpm旋转振荡使细胞生长至静止期（OD460-3.5-4.0）。
    注：MsrA-StrepII和His6-UbaA的异位表达在火山口菌株中是组成型的;因此，不需要诱导器。
2. 准备 E。用于MsrA-StrepII和Flag-His6-SAMP2纯化的大肠杆菌细胞如下。
  1. 将质粒pJAM3200（用于MsrA-StrepII的纯化）和pJAM1132（用于纯化Flag-His6-SAMP2）新鲜转化为E.通过如先前报道的化学转化（Hanahan等人，1991），通过大肠杆菌Rosetta（DE3）。
  2. 用卡那霉素（50μg·ml-1）（LB + Km培养基）在固体LB培养基（配方2）上涂铺细胞，选择转化体并在37℃孵育14小时。
  3. 将约100个新鲜转化细胞的菌落转移到25ml LB + Km液体培养基中（在250ml带盖箔片的挡板培养瓶中），使用10ml移液器将5ml LB + Km培养基加入到平板中以重新悬浮并转移。
    注意：并非所有的蛋白质都需要这种类型的方法，但我们确实发现如果细胞未被新鲜转化，我们使用的蛋白质子集不易在大肠杆菌中表达。请注意，即使在不存在IPTG的情况下，使用pET系统也可在大肠杆菌中表达一些蛋白质，这可导致轻微的毒性并选择显示靶基因表达缺失的细胞。我们不希望发生这种类型的风险，即本研究的MsrA和/或其他蛋白在大肠杆菌中的表达水平低。
  4. 在37℃下在25ml培养基中培养细胞，以220rpm的旋转振荡至对数期（OD 600在0.6-0.8）。
  5. 将细胞继代培养到500ml新鲜的LB + Km培养基中（在箔中覆盖的2.8L Fernbach瓶中）至最终OD 600≤0.01，并使细胞生长至对数生长期（OD 600） > 0.6-0.8）在37℃下以220rpm旋转摇动。
  6. 在E中诱导蛋白质表达。加入0.4mM IPTG。诱导后，在收获前将细胞培养物以200rpm的速度转移至25℃12小时。
3. 收获 H。 volcanii 和 E。使用带有Fiberlite F9-4x 1000y固定角度超速转子的Sorvall Evolution RC离心机通过离心（4,500xg，10分钟，15℃）培育大肠杆菌细胞。
4. 在配制用于HisTrap或StrepTrap HP层析的裂解缓冲液（配方3和4）中以每湿重细胞团粒4-5体积重悬细胞。
5. 使用French Press在24,000 psi的压力下将重新悬浮的细胞材料通过冷冻法式压力机通过4-6次。将细胞裂解液收集在冰上的50ml聚丙烯Nalgene离心管中。
6. 使用带有Sorvall SS-34固定角转子的Sorvall Evolution RC离心机通过离心（12,000xg，20分钟，4℃）澄清细胞裂解物。
7. 使用SFCA注射器过滤器（0.8μm，然后0.45μm孔径）过滤细胞裂解物。
8. 在室温下进行所有色谱步骤（因为嗜盐蛋白通常是耐热的）。用5-10个柱体积的Tris-盐缓冲液pH7.4（方案5）平衡柱子。
9. 将澄清的裂解物温热至室温，并将样品以1ml∙min -1 -1或StrepTrap HP柱（1ml）的流速应用于HisTrap HP柱（5ml床体积，GE Healthcare）床体积，通用电气医疗集团），流速为0.5 ml·min -1 -1。使用BioLogic DuoFlow 10系统控制色谱流速。通过A 280监测蛋白质组分。
10. 通过用140ml Tris-盐缓冲液pH7.4以1.2ml·min -1 -1的流速洗涤柱来除去未结合的蛋白质。
11. 在补充有5mM二硫键生物素（对于StrepII标记的蛋白质）或500mM咪唑（对于His6标记的蛋白质）的Tris-盐缓冲液pH7.4中洗脱结合的蛋白质蛋白质）。
  在13毫米硼硅酸盐玻璃管中收集1毫升级分
12. 使用小部分洗脱级分（通常5μl就足够了），然后进行考马斯蓝染色，以确认洗脱级分中存在目标蛋白质，可以进行12％SDS-PAGE的降低。
13. 使用具有Ultracel-3膜（Merck）的Ultra-4离心过滤器单元在HL-8摆动斗式转子中在4℃和4,000gxg下通过离心过滤浓缩洗脱的蛋白质级分。我们建议将洗脱的组分浓缩至最终体积约1 ml。
14. 通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蛋白质，将0.5ml蛋白质样品加入在Tris-盐缓冲液（pH7.4）中平衡的Superdex 75 10/300 GL柱（GE Healthcare），流速为0.3ml·min -1 。基于A 280收集峰分数。根据需要重复该色谱步骤。 His6-UbaA纯化为二聚体，而Flag-His6-SAMP2和MsrA-StrepII纯化为单体。
15. 检查洗脱级分的纯度，如上面步骤A12所示。施加到凝胶上的每个级分的体积应基于A 280进行调节：通常对于0.5的A 280，7.5μl的蛋白质就足够了。
16. 根据需要重复步骤A13-A15，直至达到所需的纯度。通常，两次连续的凝胶过滤色谱步骤将产生高度纯化的蛋白质制剂。
17. 一旦蛋白质制备纯度足够高，使用Amicon Ultra-4浓缩蛋白至100μl或更少的终体积。
18. 根据供应商使用牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质标准物，通过BCA蛋白质测定法测量蛋白质浓度。将纯化的蛋白质储存在4°C以备将来检测。
  注意：纯化的蛋白质可以在4°C下保存1个月。
制备用于体外重构测定的细胞裂解物
1. 种植Hfx的文化。与步骤A1a至A1c相似，在25ml的ATCC974培养基中加入火山vol vol LR LR LR LR LR LR <<<<<<<<
2. 在含有或不含25mM DMSO的500ml ATCC974培养基（在2.8L Fernbach瓶中）中将细胞传代至0.01的OD 600。在42℃下以200rpm旋转振荡使细胞生长至静止期（OD460-3.5-4.0）。
3. 使用带有Fiberlite F8-6 x 1000y固定角度超速转子的Sorvall Evolution RC离心机通过离心收获细胞（4,500xg，10分钟，15℃）。
4. 将细胞重悬于8ml Tris-盐缓冲液（pH 7.4），10mM MgCl 2，100μM硼替佐米（LC Laboratories）和30μg·ml -1 DNase I来自牛胰腺（Sigma-Aldrich）。稀释溶解于99.8％（wt / vol）DMF中的200mM硼替佐米储备液中的硼替佐米。
5. 通过French Press（20,000psi）的溶胞细胞（类似于步骤A5）。
6. 使用具有Sorvall SS-34固定角转子的Sorvall Evolution RC离心机通过离心（12,000xg，20分钟，4℃）澄清细胞裂解物。
7. 使用0.2μmSFCA注射器过滤器过滤裂解物。
8. 通过透析（3次，在4℃）细胞裂解物对补充有2M NaCl的50mM Tris-Cl，pH 7.4，研究不同化学试剂对刺激SAMP缀合物形成的作用。例如，将7ml细胞裂解液装入透析管（3.5kDa MWCO，根据制造商说明书Fisher Scientific预湿的SnakeSkin）中。将样品放入4L缓冲液中，并在4℃下搅拌缓冲液1.5至2小时。用新鲜缓冲液替换透析缓冲液，并在4°C下透析样品1.5至2小时。对样品重复最后一步，共进行三次缓冲液交换。
9. 根据供应商使用牛血清白蛋白（BSA，Thermo Scientific）作为蛋白质标准物，通过BCA蛋白质测定法（Thermo Scientific，Rockville，IL）测量细胞裂解物的蛋白质浓度。将细胞裂解液储存在4°C以备将来检测。
  注意：我们建议在制备后8小时内使用细胞裂解液进行体外测定。
MsrA依赖性sampylation体外重建
1. 在微量离心管中，按照显示的顺序将下表中列出的各组分合并。
  
  备注：
  1. 如果目的是从体外重建测定中纯化和鉴定SAMP偶联物，将总反应体积设定为1.6ml并使用2.0ml微量离心管。
  2. 我们总是使用新鲜制备的浓缩测定缓冲液用于每个体外重建测定。选择性地从测定中除去作为对照的Mg-ATP，DMSO和蛋白质组分。 MsrA-StrepII可从E.coli或H. volcanii LR03（ΔmsrAΔubaAΔsamp1/ 2/3，一种sampylation缺陷菌株）中纯化，对偶联物形成没有可检测的影响。
  3. * His 6 -UbaA的指示摩尔浓度反映了His 6 -UbaA单体的分子量，尽管His 6 -UbaA被纯化为二聚体。例如，5μM* His6-UbaA相当于154μg·ml-1 His6-UbaA。
2. 将反应液在45°C水浴中孵育0,2,4,8和18小时。
3. 将1.6ml反应样品分成2份（80μl用于蛋白质印迹，剩余1.52ml用于如步骤D所述纯化SAMP缀合物）。分析后，根据供应商的说明书（Thermo Scientific），使用Zeba Spin Desalting Columns（7K MWCO）从80μl反应混合物中除去盐。在应用样品前，在pH 6.8的50 mM Tris-Cl缓冲液中平衡柱子。使用Eppendorf微量离心机在室温下将柱子在1,500xg 离心1分钟。
  最终样品体积为100μl
4. 通过将脱盐的样品与等体积的2x SDS还原缓冲液混合来终止反应（配方7）。煮沸样品3 x 5分钟。每次沸腾后涡旋30秒。
5. 将反应产物应用于泳道2-10，并将精确加蛋白双色分子量标准品（2.5μl）应用于还原12％SDS-PAGE凝胶的泳道1（配方8）。施加的样品量可能需要根据检测灵敏度进行调整;良好的起点是3.5μl用于通过抗Flag抗体进行检测，并且6μl用于抗StrepII或抗His抗体。通过在室温下在1×运行缓冲液（从10×储备液，配方9稀释）中在150V电泳分离样品70-90分钟。
6. 根据供应商的说明书（Bio-Rad），在90 V下使用迷你trans-blot模块在transblot缓冲液（配方10）中将蛋白转移至PVDF膜上4°C，或在20 V下过夜。
7. 从盒中取出膜。
  使用铅笔标记凝胶的位置和膜上的蛋白质标准。
8. 将膜直立放入18 x 10厘米的塑料容器中。用25ml 1×TBS简单冲洗膜。
9. 在室温下封闭膜1小时或在4℃在25ml封闭缓冲液中过夜，所述封闭缓冲液由补充有10％（w / v）脱脂奶粉（Publix）的TBST缓冲液（配方11-12）组成。在BenchRocker 2D Rocker（Alkali Scientific Inc）的中型设置中，在阻挡步骤中缓慢摇动膜片。
10. 按以下稀释度将一抗加入到10ml封闭缓冲液中：1:5,000的抗Strep-tag II抗体以检测MsrA-StrepII，1:5,000的抗-His IgG2单克隆抗体以检测His-sub > 6-UbaA和1：10,000的碱性磷酸酶连接的抗Flag M2单克隆抗体以检测Flag-His 6 -SAMP2。使用摇杆的中等设置，在室温下孵育膜与主要抗体溶液60分钟。
11. 使用摇杆的高设置，用25-50ml TBST缓冲液在室温下冲洗膜3×15-30分钟。
12. 为了检测抗Strep标签II和抗His一抗，将膜与二抗的抗体（山羊抗小鼠IgG（全分子） - 碱性磷酸酶连接的抗体）的1：10,000稀释液在封闭缓冲液中孵育并且如上所述在TBST缓冲液中冲洗膜3次。
13. 根据供应商指南，使用CDP-Star（赛默飞世尔科技）通过化学发光和暴露于X射线胶片（Thermo Fisher Scientific）在PVDF膜上显现抗体：蛋白质复合物。
  注意：可以使用HRP缀合的His 6单克隆抗体代替中止的抗His IgG2单克隆抗体。根据用户指南，使用带有X光胶片的ECL Prime检测HRP活性。
从体外重建试验纯化SAMP-缀合物
1. 通过使用Flag-His 6 -SAMP2作为底物并且使用完全His标签树脂（Roche）作为纯化树脂从体外重构测定法中纯化标准蛋白质。
2. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（50mM NaH 2 PO 4，300mM NaCl，pH 8.0）中平衡200μlHis-标签树脂（Roche）。
3. 在体外测定后，将样品（1.5ml）与8.5ml PBS [5mM EDTA，5mM DTT，1mg / ml -1无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），50mM NaH 2 PO 4，300mM NaCl，pH 8.0]中，然后施加到His-标签树脂（200μl）上。
  为了提高蛋白质产量，将样品流过树脂一次注意：总反应体积为1.6毫升。使用0.1ml通过蛋白质印迹分析SAMP缀合反应产物，剩余的1.5ml用于纯化SAMP缀合物。
4. 用40倍柱体积的PBS缓冲液洗涤His-tag树脂去除非特异性蛋白质。
5. 通过加入80μl补充有200mM咪唑的PBS从树脂中洗脱结合的蛋白质。
6. 用洗脱缓冲液将树脂转移到一个新的微量离心管中，并在4℃下旋转20分钟。使用Eppendorf微量离心机在4℃下（在冷室中）将样品在10,000×g下离心10分钟。
7. 小心取出70μl的上清液，不要触摸树脂。
8. 将上清液与等体积的2x SDS还原缓冲液混合，并在每次沸腾后用30秒漩涡煮沸2 x 5分钟。
9. 通过12％SDS-PAGE分离蛋白质。按照制造商的指示，通过免疫印迹法和通过SYPRO Ruby（Bio-Rad）随后Bio-Safe Coomassie（Bio-Rad）染色总蛋白质来分析平行凝胶中的样品。在凝胶切片中切下主要的SAMP-缀合物条带进行质谱分析。
  在此分析中包含阴性对照的凝胶片。
  注意：将10μl样品用于总蛋白染色和随后的切除以进行质谱分析。对于免疫印迹分析，应用3.5μl用于通过抗Flag抗体进行检测，并且用6μl用于抗StrepII或抗His抗体。

数据分析

系统地在体外试验中添加不同的组分以研究其过程。终止不同时间点的反应以确定最佳反应时间。 MsrA依赖性sampylation的体外重构已经在mBio中发表（Fu等人，2017）。代表性数据的图1最初发表在我们以前的论文（Fu等人，2017）中的图4A中。 50kDa的条带对应于单腺苷酸化的UbaA（图1，泳道12）。当在DMSO存在下加入所有组分时观察到与自修饰的UbaA不同的MsrA依赖性SAMP缀合物（图1，泳道14和19）。

图1.纯化的MsrA-StrepII与Flag-His孵育后的MsrA-StrepII复合物。图1.纯化的MsrA-StrepII与Flag-His 6-SAMP2，His6-UbaA和ATP（4mM）在45℃下孵育0-18小时。 DMSO浓度为25mM。反应物补充有hfx的细胞裂解物。 volcanii LR03（ΔmsrAΔubaAΔsamp1/ 2/3，一种桑白酶缺陷型菌株）。测定后的蛋白质通过减少12％SDS-PAGE进行分离，并通过左侧所示的抗StrepII，抗Flag和抗N-末端His免疫印迹（IB）进行分析。分子量标准（M r，kDa）的迁移在左侧标出。右边注明了SAMP2，SAMP2结合物，MsrA，UbaA和sampylated UbaA（◄UbaA *，后者修改为独立于MsrA）的迁移。该数据集最初发表于Fu等人（2017）。

笔记

请注意，我们目前对古细菌中的sampylation的了解并不完整。因此，我们使用hfx的细胞裂解液。 volcanii LR03（ΔmsrAΔubaAΔsamp1/ 2/3，一种桑白酶缺陷型菌株）作为蛋白质底物的资源和另外的缺失组分需要进行sampylation。未来的研究将非常重要，以确定所需的所有组分进行sampylation并进行完整的体外重建sampylation只使用系统的纯化组件。

食谱

ATCC974培养基
1. 溶解125g NaCl，50g MgCl 2·6H 2 O，5g K 2 SO 4，0.132 g CaCl 2·2H 2 O，5g胰蛋白胨和5g酵母提取物在750ml去离子H 2 O中的溶液。当所有的化学物质都完全溶解后，培养基就会变成清澈的溶液。
2. 通过逐滴加入0.5 N NaOH将溶液的pH调节至6.8
3. 调整溶液的体积至最终1 L
4. 液体循环高压灭菌25分钟
LB培养基
1. 10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克NaCl溶于1升去离子水中
2. 液体循环高压灭菌25分钟
注意：对于配方1和2，将适量浓度的抗生素（作为粉末）加入冷却的培养基中。对于平板，在高压灭菌之前，每升培养基加入15克琼脂。高压灭菌后，将培养基冷却至60°C 1-2小时，然后每培养皿分配约20毫升培养基。让板在室温下盖上盖子干燥1-2天。将液体培养基在室温或4°C黑暗条件下（无论培养基中含有抗生素还是固体培养皿）储存在无菌瓶中。由于嗜盐古细菌对冷休克敏感，所以在室温下在4℃下储存板状火山和液体培养物。使用前，请将所有介质加热至室温。
用于HisTrap HP亲和色谱的裂解缓冲液
50 mM Tris-Cl，pH 7.4
2 M NaCl
40 mM咪唑
1 mg·ml -1无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche）
用于StrepTrap HP色谱的裂解缓冲液 50 mM Tris-Cl，pH 7.4
2 M NaCl
1 mg·ml -1无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche）
Tris-盐缓冲液
50 mM Tris碱
2 M NaCl

用浓盐酸滴定至pH 7.4或7.5
浓缩的检测缓冲液
50 mM Tris-Cl，pH 7.5
40 mM ATP
250 mM DMSO
20 mM MgCl 2 2/2 5 mM DTT
2 M NaCl
2x SDS减缓缓冲液
pH 6.8的100mM Tris-Cl缓冲液 4％（w / v）SDS
20％（v / v）甘油

0.6 mg·ml-1溴酚蓝 5％（v / v）β-巯基乙醇
12％SDS-PAGE凝胶
1. 根据Bio-Rad在Mini-PROTEAN Tetra Handcast系统中浇铸凝胶，具有以下几点清晰度
2. 分离凝胶：3.4ml去离子H 2 O，2.4ml 40％丙烯酰胺，2ml 1.5M Tris pH8.8,80μl10％SDS，80μl10％APS和8μlTEMED缓冲液>
3. 在第一次聚合之前用去离子H 2 O将层积凝胶的顶层层叠
4. 堆积凝胶：2.9ml去离子H 2 O，0.75ml 40％丙烯酰胺，1.25ml 0.5M Tris pH6.8,50μl10％SDS，10％APS和5μlTEMED
5. 凝胶可以包裹在湿的Kimwipe和塑料包装中，并在4°C下储存长达1周
10倍运行缓冲区
1. 将30g Tris碱，144g甘氨酸和10g SDS溶解在1L dH 2 O中。
2. 不需要调整pH值。缓冲液的pH值应为8.3
3. 在室温下储存并在使用前稀释至1x
Transblot缓冲区
500毫升0.2 M MES缓冲液pH 6
1升100％甲醇
8.5升去离子水
在4°C储存
10x TBS（浓缩的Tris缓冲盐水）
1. 将24克Tris碱和88克NaCl溶于900毫升蒸馏水中
2. 用12 N HCl将pH调节至7.6
3. 加入蒸馏水至最终体积为1升
含0.1％吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水
将100ml TBS 10x与900ml蒸馏H 2 O和1ml吐温20混合。

致谢

这项工作是由美国能源部，基础能源科学办公室，化学科学部，地球科学和生物科学部，物理生物科学计划（DE-FG02-05ER15650），美国国立卫生研究院|国家综合医学研究所（NIGMS）（NIH R01 GM57498-15）和美国农业部国家食品与农业研究所（Hatch 1005900）。该协议是根据Fu等人发表的以前的工作改编的。作者没有利益冲突或竞争利益声明。

参考

Fu，X.，Adams，Z.，Liu，R.，Hepowit，N.L.，Wu，Y.，Bowmann，C.F.，Moskovitz，J。和Maupin-Furlow，J.A。（2017）。甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）及其在古细菌泛素样蛋白修饰中的功能 a> MBio 8（5）。
Glickman，M.H。和Ciechanover，A。（2002）。泛素 - 蛋白酶体蛋白水解途径：为了构建而破坏。 Physiol Rev82（2）：373-428。
Hanahan，D.，Jessee，J.和Bloom，F.R。（1991）。大肠杆菌和其他细菌的质粒转化。 Methods Enzymol 204：63-113。
Hepowit，NL，de Vera，IM，Cao，S.，Fu，X.，Wu，Y.，Uthandi，S.，Chavarria，NE，Englert，M.，Su，D.，Sll，D.，Kojetin， DJ和Maupin-Furlow，JA（2016）。机理性洞察蛋白质修饰和硫代动力学活动的noncanonical E1和相关泛素样蛋白质的古细菌。 FEBS J 283（19）：3567-3586。
Komander，D。和Rape，M。（2012）。泛素编码
Maupin-Furlow，J.A。（2014）。原核泛素样蛋白修饰 Annu Rev Microbiol 68：155-175。
Zhao，Q.，Liu，L。和Xie，Q。（2012）。体外蛋白质泛素化分析方法Mol Biol 876：163-172。