材料和试剂

根据需要10毫升试管（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
根据需要，聚丙烯管2毫升（Denville Scientific，目录号：C2170）*
根据需要加入2毫升聚丙烯管（请参阅材料和试剂＃2）**
Parafilm *（Bemis，目录号：PM996）
移液器吸头（1,000μl; 200μl）（Corning，目录号：4846; USA Scientific，目录号：1111-1006）
带压缩空气的气缸（AirGas Mid-America，呼吸质量等级D）
压缩氮气瓶（AirGas Mid-America）**
50毫升烧瓶（Corning，PYREX®，产品目录号：4442-50）
烧瓶盖（Fisher Scientific，目录号：05-888）
细菌细胞培养
乙二胺四乙酸，二钠盐，二水合物，EDTA（Fisher Scientific，目录号：S311）
胱氨酸二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C2526）
5,5-二硫双（2-硝基苯甲酸），DTNB（Sigma-Aldrich，目录号：D8130）
4-氨基-N，N'-二甲基苯胺，DMPDA（Sigma-Aldrich，目录号：07750）
六水合氯化铁（III）（Sigma-Aldrich，目录号：F2877）
磷酸钾，一元或二元（Fisher Scientific，目录号：P284，P288）
乙醇，100％（Decon Labs，目录号：2716）
氢氧化钾（Fisher Scientific，目录号：P250）
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16）
硫酸铵（Fisher Scientific，目录号：A702）
柠檬酸钠（Fisher Scientific，目录号：S279）
盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
硫化钠九水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S4766）
硫酸镁七水合物（Fisher Scientific，目录号：M63）
去离子水（伊利诺伊大学去离子系统）
库存解决方案（请参阅食谱）
备注：
*这些项目用于基于DMPDA的测量。
**这些项目用于基于DTNB的测量。

设备

对于基于DMPDA的测量
1. 移液管，1和0.2ml（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17014382,17014384）
2. 微量离心机（Fisher Scientific，型号：accuSpinTM Micro 17，目录号：13-100-675）
3. 分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU-640）
4. 摇晃水浴（New Brunswick Scientific，型号：G76D）
5. 加热器（Fisher Scientific，目录号：11-718）
用于基于DTNB的测量
1. 两个125毫升的气体清洗瓶，带有粗糙的多孔圆盘（Corning，PYREX ®，产品目录号：31760-125C）
2. 水浴（Shel-Lab，VWR，型号：Model 1250）

程序

排泄的有机硫醇的测量
1. 成长E。在含有硫酸盐作为唯一硫源如最小A培养基（Chonoles Imlay等人，2015）的培养基中，将大肠杆菌培养物（> 5ml）加入到OD 0.1中。 br />
2. 在细菌培养基中加入0.1 mM EDTA
3. 向培养物中加入0.2mM胱氨酸。打开摇床，让文化混合10秒。
4. 每2-5分钟取出1毫升细菌培养液
5. 使用微量离心机（13,800 x ）离心1-ml等分试样（30-60秒）。
6. 将0.5ml上清液放入试管中，用氮气剧烈鼓泡至少30秒以除去硫化氢。
7. 用0.5 ml的DTNB试剂通过移液3-4次将发泡的上清液混合
8. 允许反应至少1分钟，然后测量412nm处的吸光度。
9. 用13 OD / mM半胱氨酸的消光系数计算硫醇浓度。将得到的值乘以2以纠正DTNB试剂的稀释。
注意：喂食胱氨酸的大肠杆菌细胞分泌大量硫醇（在0.1OD下每分钟3-4微摩尔）。排泄出来的巯基主要是半胱氨酸（约90％）和硫化氢（约10％）。质谱分析显示其他生物硫醇即谷胱甘肽的释放可忽略不计（Korshunov等，2016）。半胱氨酸在充气介质中可能不稳定，因为偶发金属可以催化其氧化;因此，包含EDTA以阻断该反应。氮气鼓泡对于从溶液中除去硫化氢是必需的。典型的结果如图1所示。

图1.半胱氨酸排泄的取样时间过程野生型（MG1655）E的上清液中半胱氨酸的累积累积。添加胱氨酸后追踪大肠杆菌培养物。细胞在最小葡萄糖培养基中为0.1OD。在时间点零时添加胱氨酸。
培养基中半胱氨酸累积速率为3.1μM/ min
一次性硫化物测量密封文化
1. 成长E。在含有硫酸盐作为唯一硫源的培养基如最小A培养基（Chonoles Imlay等，，2015）中培养大肠杆菌培养物至OD 0.1。
2. 在37℃的加热器中将1ml细菌培养物转移到2ml塑料管中。
3. 加入0.1 mM胱氨酸。关闭管道并用Parafilm密封。
4. 37°C孵育10分钟。激动是没有必要的。
5. 去除石蜡膜，打开试管并迅速加入0.1ml 20mM DMPDA，然后立即加入0.1ml 30mM氯化铁。酸化会裂解细胞; DMPDA /三氯化铁将检测在之前的潜伏期释放的硫化物。关闭管道并用Parafilm密封。为避免硫化氢的流失，请勿吸管或混合培养物，直至管道关闭并密封。
6. 摇动密封管并在室温下避光保存15分钟。对照培养物不应含有胱氨酸。
7. 孵育后，移除石蜡膜，并在13,800 x g的台式离心机中离心5分钟。
8. 小心地将1毫升上清液转移到干净的塑料管中。
9. 测量650 nm处的光密度。
10. 消光系数可能因介质而异，介于16-20 OD / mM硫化物之间，典型平均值为17 OD / mM。在一些培养基（例如，含甘油的最小A培养基）中，样品的吸光度值可能随着与DMPDA一起温育而漂移;因此，添加DMPDA和吸光度测量之间的时间间隔应尽可能一致，样品间不应有差异超过2-3分钟。应使用0.5-20微摩尔范围内的硫化钠对每种培养基进行校准曲线。该方法由Siegel（1965）修改。典型的结果如图2所示。
  
  图2.细菌培养物中的样品单点硫化物测量将在最少的A葡萄糖培养基中的野生型MG1655细胞培养物（OD 0.1）在不存在或存在0.2mM胱氨酸，然后使用DMPDA测量放出的硫化氢。使用无菌培养基作为空白;注意大量的背景值。来自胱氨酸喂养的野生型细胞的悬液累积3.5微摩尔硫化物。无法将胱氨酸导入细胞（ tcyP ）的菌株不产生任何可检测到的硫化物。
开放生长期培养物中硫化物积累的时间过程
1. 成长E。在最小A培养基中以0.1％硫酸盐作为唯一硫源，培养大肠杆菌培养物至OD 0.1。
2. 将12ml培养物放入50ml烧瓶中。
3. 加入0.2mM胱氨酸。
4. 用塞子密封烧瓶。以180转/分摇动培养物。
5. 每5分钟取1毫升样品。不要让烧瓶打开超过5秒钟。
6. 从“密封培养的一次性测量”部分执行步骤B4-B8。
添加DMPDA和实际测量样品之间的时间间隔应该是恒定的。由于在取样过程中会有部分硫化物丢失，预计实际硫化物产量低估约为10-20％。这个值可以用硫化钠的标准样品检查。
如果培养基中存在高半胱氨酸浓度（> 5mM），则用于硫化物测定的基于DMPDA的方法可能无法正常工作。这种方法的缺点是，尽管可靠性和灵敏度很高，但在低硫化物浓度下信号/背景比率并不是最佳的（见图1）。为了解决这种情况，我们开发了一个简单而敏感的DTNB依赖系统，该系统采用碱性陷阱。
基于DTNB的程序与碱性陷阱
1. 成长E。在最小的A培养基中以0.1％的硫酸盐作为唯一的硫源培养大肠杆菌培养物至OD 0.1。
2. 将一个洗气瓶的出口与另一个洗瓶的出口连接起来（图3）。
  
  图3.连续捕获由培养物释放的硫化物的排列A.瓶1含有活性细菌培养物，可位于水浴中。瓶子1的入口用压缩空气连接到缸体上;瓶子的出口连接到含有碱性溶液的瓶子2的入口。瓶2的出口未被密封。在瓶子1中加入胱氨酸后，该瓶子的瓶盖通过橡胶或金属弹簧钩固定在瓶身上。每隔一段时间，从瓶子2取出样品并测定硫化物。 B.硫化物陷阱的照片描述。
3. 用75-100ml的细菌培养物（0.3-0.4 OD）填充第一瓶（瓶1）。
4. 用等体积的0.1M KPO缓冲液（pH 11）填充另一瓶（瓶2）。
5. 设定空气流量为0.3-0.4 L / min。（空气流量很容易通过量化管道被引入倒水充分量筒时的排水量来测量）。
6. 加入0.5 mM胱氨酸并密封瓶子。空气流通过细菌培养物并将释放的硫化氢携带到下一瓶中的碱性溶液中。硫化氢被去质子化并因此被困在瓶子2的碱性溶液中。
7. 定期除去0.5ml碱性溶液并将其与0.5ml在0.5M KPO 4（pH7）中的0.5mM DTNB溶液混合。测定412nm处的吸光度。
8. 使用26 OD / mM硫化氢的消光系数计算硫化氢含量。请注意，应对样品溶液1：1稀释到DTNB溶液进行校正。
从细菌培养物中除去硫化物的速率与其在培养基中的浓度成比例，因此瓶子2中硫化物的积累速率将随时间增加，直到瓶子1中的细胞形成硫化物的速率等于硫化物的速率去除瓶2（图4）。由于不完全的气体：液体交换过程，来自气体混合物的一小部分硫化物不会被困在瓶2的碱性溶液中。这部分可以通过将标准量的硫化钠加入瓶1并量化其在瓶2中的回收来确定。该熔块的目的是产生更小的气泡以增强交换;一般的技术可以使用移液器进行复制，但硫化物捕集可能效率较低。

图4.碱性捕获器中硫化物积累的样品时间过程硫化氢的形成通过在最小的A葡萄糖培养基中添加0.5mM胱氨酸至MG1655培养物（0.3OD）开始。加入胱氨酸后，将细胞培养物密封。空气流量为0.35升/分钟，悬浮体积为75毫升，收集体积为75毫升。 0.1 KPO缓冲液4作为空白。每隔一段时间，将等分试样从捕集器中取出，通过DTNB处理定量硫醇含量。初始滞后表示培养物中初始硫化物积累所需的时间;最终斜率代表了细菌对硫化物进化的速度。
测定碱性阱的效率
1. 用75-100毫升含有10微摩尔硫化钠的培养基填充瓶子1
2. 用等体积的碱性溶液填充瓶子2
3. 每个瓶子取0.5毫升样品，并与0.5毫升DTNB溶液混合。
4. 密封瓶1并将空气流量调节至0.3-0.4 L / min。
5. 鼓泡10分钟，然后重复步骤E3。
6. 比较两个瓶子的OD变化。来自瓶子1的预充气和充气后样品的OD的下降表示通过充气去除的硫化物的量。来自瓶2的预充气和充气后样品的OD的上升表示成功捕获的硫化物的量。因此，陷阱的效率是（ΔOD瓶2）/（ΔOD瓶1）。在我们的实验中观察到的效率约为80-85％。
注意：我们所有的细菌培养都是在37°C下处理的。出于这个原因，洗涤管保存在预热的水浴中。

数据分析

使用标准样品的吸光度值将吸光度变化率转换为分析物浓度变化率，从数据斜率计算半胱氨酸排泄率和硫化物排泄率（参见图1和3）。 DMPDA测定细菌培养物中的硫化物依赖于每个样品的单次测量;在计算实验样品的硫化物含量之前，减去不含硫化物样品中的空白。可以确定每个点的技术重复次数并取平均值，并计算出最佳拟合曲线。如下所述，大多数变化来自生物方差，根据所研究的现象，其具有不同的来源;因此，鼓励工作人员测量生物学复制品，但这里没有涉及变异的性质和程度。
样本之间的技术变化是适度的。用2％的标准误差测量培养上清液中的三微摩尔半胱氨酸。用7％的SEM检测培养上清液中3微摩尔硫化物。用2％的SEM检测碱性阱中的三微摩尔硫化物。如果实验者确信实际排泄率在测量过程中不发生变化，则通过获得多个时间点可以提高半胱氨酸和硫化物陷阱分析的精确度。

笔记

数据的变化主要取决于生物学方面的差异，而不是技术上的重复。有许多场景可能会吸引生物学家的兴趣，因此我们不试图强调可能影响细胞行为波动的问题。通常，硫化氢的排泄取决于半胱氨酸/胱氨酸输入的效率和脱硫酶的效价;每个负责的蛋白质都受到调节（Korshunov等人，2016年）。类似地，半胱氨酸流出速率也取决于诱导的出口系统水平（Chonoles Imlay等人，2015）。因此，鼓励希望跟踪硫化物或半胱氨酸流出速率的实验者严格控制细胞处理方案，特别是在培养基，时间和温度方面。

食谱

库存解决方案（新鲜制备，储存在冰上）
在100％乙醇中的50mM DTNB
在6M盐酸中的20mM DMPDA
在1M盐酸中的30mM氯化铁
在0.2M盐酸中的50mM胱氨酸
50mM EDTA，pH8.0
缓冲液和媒介股票的媒介
0.5M磷酸盐缓冲液：5g KH 2 PO 4 4，11g K 2 HPO 4 4，200ml的去离子水;调整pH值至7.0
用于碱性阱的0.1M磷酸盐缓冲液：20ml与80ml去离子水混合的0.5M磷酸盐缓冲液。
使用6 M KOH调节pH至11 去离子水中0.5M硫酸镁，高压灭菌30分钟 20％葡萄糖（w / v）：在100ml去离子水中的20g葡萄糖，高压灭菌30分钟
最小中等
1.05克K 2 HPO 4 4克/克 0.45克KH 2 PO 4 4 0.1克（NH 4）2 SO 4 4 /
0.05克柠檬酸钠二水物

100毫升去离子水注意：将培养基高压灭菌30分钟，冷却至室温，然后加入0.1ml 0.5M硫酸镁和1ml 20％葡萄糖。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院GM101012资助。基于DMPDA的方法先前在Siegel（1965），Anal Biochem 11：126-132中描述。
没有利益冲突或竞争利益需要申报。

参考

Chonoles Imlay，K. R.，Korshunov，S.和Imlay，J. A.（2015）。两种大肠杆菌胱氨酸进口者的生理作用和不良反应。 J Bacteriol 197（23）：3629-3644。
Korshunov，S.，Imlay，K.R。和Imlay，J.A。（2016）。大肠杆菌细胞色素bd氧化酶阻止内源性和外源性呼吸抑制硫化氢。分子微生物学 101（1）：62-77。
Oguri，T.，Schneider，B。和Reitzer，L。（2012）。肠道沙门氏菌中的半胱氨酸分解代谢和半胱氨酸脱氢酶（CdsH / STM0458） serovar鼠伤寒“ J Bacteriol 194（16）：4366-4376。
Siegel，L.M。（1965）。硫化物的直接微量测定。 Anal Biochem 11：