材料和试剂

整个胚胎肺分离
1. BD 1毫升TB注射器26克（BD，目录号：309625）
2. 50ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1062-P（1000799））
3. 培养皿（Greiner Bio One International，目录号：663161）
4. Shh Cre小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：005622）
5. Rosa mTmG / +小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：007576）
6. 来自Shh Cre / +，Rosa mTmG / +小鼠的小鼠胚胎肺
  注：小鼠胚胎肺来自Shh Cre / + ;在E10.5和E12.5之间收获Rosa mTmG / + 小鼠。阴道塞检测当天被认为是E0.5
7. 全身麻醉：氯胺酮（VET 1，NDC 13985-702-10）和甲苯噻嗪（AnaSed Injection，NDC 59339-110-20）
8. 70％乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP8201500）
9. 磷酸盐缓冲液（PBS）（1x），液体，不含钙和镁（Corning，目录号：21-040-CV）
10. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
11. PBS与P / S（见食谱）
整个胚胎肺文化
1. 12孔板（Denville Scientific，目录号：T1012）
2. 一次性移液器，无菌（VWR，目录号：414004-036）
3. 剃须刀片（VWR，目录号：55411-050）
4. Nuclepore Polycarbonate Track-Etch膜（13 mm，8μm）（GE Healthcare，目录号：150446）
5. Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM / F12）（1x），液体，1:1含有GlutaMAX但不含HEPES缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10565042 ）
6. 青霉素 - 链霉素（P / S）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
7. BenchMark胎牛血清（Gemini Bio-Products，目录号：100-106）
8. 胚胎肺培养基（见食谱）

设备

手术器械包括：
1. 2 Dumont＃5镊子（精细科学工具，目录号：11295-10）
2. Moria 勺（穿孔）（Fine Science Tools，目录号：10370-17）
小鼠尸检仪器包括：
1. Metzenbaum（Lahey）剪刀（Roboz手术器械，目录号：RS-6950）
2. 微型解剖剪刀4“Blunt（Roboz手术器械，目录号：RS-5980）
3. Graefe镊子直（Roboz手术器械，目录号：RS-5130）
4. Graefe镊子弯曲（Roboz手术器械，目录号：RS-5135）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM 150i）。
荧光立体显微镜（Carl Zeiss，型号：Zeiss SteREO Discovery.V8，放大8倍），配备5 MP，36位，珀耳帖冷却蔡司Axiocam MRc5相机（卡尔蔡司，型号：AxioCam MRc 5）

软件

禅蓝色软件（卡尔蔡司）
PRISM软件版本7

程序

胚胎肺隔离
1. 按照机构动物护理和使用方法，通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪（氯胺酮100mg / kg，赛拉嗪10mg / kg）和30G针，将定时怀孕小鼠（在交配后11.5-12.5天）置于全身麻醉下委员会批准的协议（见注1）。
2. 一旦进入手术平面（通过缺乏脚趾捏和眨眼反射来确定），腹部用70％乙醇冲洗（见注2）。
3. 为了收集子宫，用Graefe钳子抓住皮肤并用Lahey剪刀切开并手动打开切口。打开腹膜腔，将包含胚胎的子宫结构外化并通过手术去除两个子宫角。
4. 将子宫转移到装有补充有P / S的冷PBS并冲洗以除去血液的50ml锥形管中。
5. 将子宫转移到填充有补充有P / S的PBS的培养皿中，并使用具有明场光纤照明的体视显微镜进行可视化。通过用一对杜蒙钳手动打开子宫壁去除子宫的胚胎。
  使用穿孔勺将胚胎收集并转移到保存在冰上的新培养皿中。
6. 将显微镜切换到荧光模式并使用GFP通道;从现在起解剖将在荧光通道下。
7. 将每个胚胎放在其左侧，并使用488nm（GFP）过滤器通过落射荧光显影（图1A）。通过自动荧光可以看到大脑和四肢。使用一对镊子来稳定胚胎，同时用第二对镊子轻轻地去除皮肤组织。首先取下右前肢，然后沿右侧从脖子向腹部打开胸部（图1B）。暴露的肺和食道将显示清晰的GFP荧光，其在背景自动荧光之上可见。将心脏和肝脏移除以完全暴露肺和胃肠道，所有这些都将由GFP标记（图1C-1D）。取出胃和远端胃肠道结构，用镊子将剩余的GFP阳性组织（肺和食管）切除，从周围的结缔组织中轻轻地分离。
  任何剩余的外膜组织都应仔细从分离的肺部取出（图1E和1F）。
8. 使用无菌移液管将分离的肺组织转移至含有胚胎肺培养基的12孔板的各个孔中。
  
  图1.从Shh Cre / +中分离E12.5胚胎肺; Rosa mTmG / +小鼠的荧光显微镜观察.A.1 E12.5 Shh Cre / +的整个胚胎视图; Rosa mTmG / +小鼠，其具有GFP（绿色）和RFP（红色）荧光的双重检测。 B.取下右前肢并沿右侧暴露胸腔后观察。光盘。去除心脏和肝脏后的肺和胃肠道视图。 E.肺和食管。 F.去除食道后的肺。
胚胎肺文化
注意：从现在开始，每个步骤应该在无菌环境中进行，如组织培养罩。
1. 每孔加入2ml胚胎肺培养基。
2. 在每个孔中放置悬浮在介质上方的核孔聚碳酸酯（光面朝下）轨迹蚀刻膜（参见注释3）。
3. 使用锋利的无菌剃须刀片去除大约1.5厘米的200微升移液枪头，并使用最终的大口径轻轻捕获一个胚胎肺，并转移到核孔聚碳酸酯轨迹蚀刻膜的上表面。
4. 通过在倒置光学显微镜下观察，确保聚碳酸酯膜上的肺是平坦的;用细镊子轻轻调整，以确保它是平的。
5. 将第二天的肺图像化（图2）。
6. 任何治疗，包括抑制剂，生长因子，siRNA等等都应包括在培养基中。
7. 将12孔板转移到37°C的潮湿细胞培养箱中，通过在所需时间点成像监测实验（图2）。
  
  图2.通过在平滑受体激动剂SAG存在下培养刺激hedgehog途径的增强，诱导中胚层增殖并阻断内胚层分支。图显示胚胎肺内胚层的全贴装荧光图像（绿色）和在含有DMSO媒介物的培养基（上4个小图）或补充有10μMSAG的培养基（下4个小图）的存在下培养0-3天的中胚层（红色）。 SAG处理诱导中分裂细胞的分支丢失和异常生长（红色），表明Sonic Hedgehog信号传导在适当调节肺部分支中发挥的作用。

数据分析

使用Zen Blue软件拍摄和处理图像，使用PRISM软件版本7进行统计分析。

笔记

任何动物工作都应遵循联邦和地方法规。
要检查麻醉深度，请使用一对镊子夹住脚趾，检查是否有任何反射，直到完全没有反射时才进行。
确保核磁聚碳酸酯轨道蚀刻膜的光滑平滑面朝下并朝向介质，粗糙面朝上。

食谱

PBS与P / S
1x磷酸盐缓冲液（PBS），液体，不含钙和镁
50U / ml青霉素 - 链霉素
胚胎肺脏培养基
DMEM / F-12，GlutaMAX TM（营养混合物F-12（1x），液体，1：1，含有GlutaMAX，但不含HEPES缓冲液）
50U / ml青霉素 - 链霉素（P / S）
10％BenchMark胎牛血清

致谢

这项工作由国立卫生研究院1T32HL134637-01，R01HL135163-01;加利福尼亚再生医学研究所CIRM LA1-06915。这里描述的协议是从Yao et。（2017）改编的。所有作者声明不存在竞争利益。

参考

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Del Moral，P.M。和Warburton，D。（2010）。小鼠胚胎全肺，分离的上皮或间充质在化学定义的条件下作为系统的外植体培养物评估分支形态发生和细胞分化的分子机制。方法分子生物学 633：71-79。
Goss，A.M.，Tian，Y.，Tsukiyama，T.，Cohen，E.D。，Zhou，D.，Lu，M.M.，Yamaguchi，T.P.and Morrisey，E.E。（2009）。 Wnt2 / 2b和β-catenin信号传导对于确定前肠中的肺祖细胞是必需的和足够的。 / a> Dev Cell 17（2）：290-298。
Metzger，R.J.，Klein，O.D。，Martin，G.R。和Krasnow，M.A。（2008）。小鼠肺部发育的分支计划 Nature 453 （7196）：745-750。
Minoo，P.和King，R.J。（1994）。肺发育中的上皮 - 间质相互作用 Annu Rev Physiol 56：13-45。
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Yao，C.，Carraro，G.，Konda，B.，Guan，X.，Mizuno，T.，Chiba，N.，Kostelny，M.，Kurkciyan，A.，David，G.，McQualter，JL和Stripp ，BR（2017）。 Sin3a在肺发育过程中调节上皮祖细胞的命运发展 144（14）：2618-2628。