材料和试剂

一次性提示
1. 10μl容量（Thermo Fisher Scientific，分子生物制品，分类号：3510-05）
2. 200μl容量（Thermo Fisher Scientific，Molecular BioProducts，目录号：3900）
3. 1毫升容量（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-502C）
100mm培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353003）
6孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353046）
12孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353043）
24孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
96孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353072）
1.5 ml微量离心管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-715C）
15ml试管（Corning，Falcon ，产品目录号：352196）
封面纸（13 x 13毫米;松浪玻璃，产品目录号：C013001）
显微镜幻灯片（Matsunami Glass，目录号：S2215）
一次性血清移液器
1. 1毫升容量（Corning，Falcon ，目录号：356521）
2. 5毫升容量（IWAKI，目录号：7153-005）
3. 10毫升容量（IWAKI，目录号：7154-010）
滤纸（ATTO，产品目录号：CB-06A-20A）
病毒（Chen et。，2017）：
1. 丙型肝炎病毒（HCV，J6 / JFH-1株）
2. 登革热病毒（DENV，特立尼达1751株）
3. 日本脑炎病毒（JEV，Nakayama株）
4. 甲型流感病毒（FLUAV，A / Udorn / 307/72 [H3N2]）
5. 仙台病毒（SeV，伏见菌株）
6. 单纯疱疹病毒1型（HSV-1，CHR3株）
7. 柯萨奇病毒B3（CV-B3，Nancy株）
8. 水泡性口炎新泽西州病毒（VSNJV）
9. 辛德比斯病毒（SINV）
10. 脑心肌炎病毒（EMCV，DK-27株）
Huh7it-1细胞（Apriyanto等人，2016）
注：Huh7it-1细胞易受上述所有病毒（HCV，DENV，JEV，FLUAV，SeV，HSV-1，CV-B3，VSNJV，SINV和EMCV）的影响。
Vero细胞（ATCC，目录号：CCL-81）
注意：Vero细胞易受上述所有病毒（HCV，DENV，JEV，FLUAV，SeV，HSV-1，CV-B3，VSNJV，SINV和EMCV）的影响。
抗体
1. 针对DENV PrM的兔多克隆抗体（Gene Tex，目录号：GTX128093）
2. 抗DENV 2型的小鼠单克隆抗体（3H5; Hotta等人，1984）
3. UV灭活的抗HCV人血清（Bungyoku等人，2009）
4. 抗HCV E2中和抗体＃55（Shimizu et al。，2013）
5. 抗CV-B3的兔抗血清（DENKA SEIKEN，目录号：300638）
6. 针对FLUAV的兔抗血清（Shimizu et al。，1985）
7. 对抗SeV的兔抗血清（Hayashi等人，1991）
8. 抗HSV-1的兔抗血清（Hayashi et al。，1986）
9. FITC缀合的山羊抗人IgG（MEDICAL＆amp; BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：104AG）
10. Alexa Flour488结合山羊抗小鼠IgG（Thermo Fisher Science，目录号：A-11001）
11. Alexa Flour488结合山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Science，目录号：A-11008）
高糖Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM; Wako Pure Chemical Industries，目录号：044-29765）
来自蛇吸血管蛇毒（Sigma-Aldrich，目录号：P7778）（Chen等人，2017）的磷脂酶A 2， >
胰蛋白酶-EDTA溶液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：209-16941）
结晶紫（Wako Pure Chemical Industries，目录号：038-04862）
具有非必需氨基酸的MEM（Thermo Fisher Science，Gibco TM，目录号：10370021）
胎牛血清（FBS; Biowest，目录号：S1820）
青霉素 - 链霉素溶液（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-23191）
甲基纤维素4000（Wako Pure Chemical Industries，目录号：136-02155）
4％多聚甲醛磷酸缓冲液（和光纯药工业，目录号：163-20145）
甲醛溶液（AppliChem，目录号：A3592,0500）
格兰姆黑客染色液I（MUTO PURE CHEMICALS，目录号：41162）
Triton X-100（Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-21105）
牛血清白蛋白（BSA; Wako Pure Chemical Industries，目录号：015-21274）
Hoechst 33342溶液（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes，目录号：H3570）
Vectashield安装解决方案（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
Formvar涂层镍网格（Electron Microscopy Sciences，目录号：FF200-Ni）
2％磷钨酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：582-66852）
氯化钠（NaCl; Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
氯化钾（KCl; Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·12H 2 O，NACALAI TESQUE，目录号：31722-45）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4; Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-04245）
细胞培养的完整培养基（见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS [ - ]）（见食谱）
覆盖媒体（见食谱）

设备

微量移液器（Gilson，P20，P200，P1000）
1. P20（Gilson，目录号：F123600）
2. P200（Gilson，目录号：F123601）
3. P1000（Gilson，目录号：F123602）
多通道微量移液器（10-100μl）（Eppendorf，目录号：3125000036）
血细胞计数器室（例如，Erma，目录号：03-303-1）
生物安全柜（，PHC，型号：MHE-S1301A2）
CO 2培养箱（例如PHC，型号：MCO-20AIC）。
高压灭菌器（例如，，TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：SX-500）
冷藏台式离心机（例如Eppendorf，型号：离心机5424）
Vortex（例如，Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
-80°C冷冻机（，例如，PHC，型号：MDF-384）
倒置显微镜（，例如，奥林巴斯，型号：CKX53）
荧光显微镜（例如，ZEISS，型号：Axio Vert A1）
多标记板计数器（PerkinElmer，型号：1420 ALBOSX）
透射电子显微镜（日立，型号：HT7700 TEM）

程序

第一部分：杀病毒和中和反应（图1）

准备在1.5ml管中的DMEM中的PLA2（或抗HCV E2中和抗体）的系列稀释液。
注：在我们的研究中，每管中PLA2浓度分别为2,20,200和2,000 ng / ml，抗HCV E2抗体浓度分别为0.2,2,20,200和2000μg/ ml。
在15ml试管中，将DMEM中的HCV原液稀释至每200μl2×10-4焦点形成单位（FFU）的浓度。
将100μlPLA2（或抗HCV E2抗体）的每种稀释液与100μlHCV溶液在1.5ml管中混合并轻轻涡旋。
注：与HCV溶液混合后，每管中PLA2（或抗HCV E2抗体）的终浓度分别为1,10,100和1,000 ng / ml（或抗HCV E2抗体：0.1,1,10,100和1,000μg/ ml）。
在37°C孵育1小时
通过荧光抗体（FA）方法，空斑测定或TCID 50测定来确定剩余的病毒感染性。有关详细步骤，请参阅第II部分。

图1.杀病毒和中和活性测试流程图的图解将固定量的病毒与连续稀释的抗病毒化合物（例如，PLA <2> （A.杀病毒活性试验）或抗体（B.中和活性试验）在37℃下接种1小时至培养细胞。通过适当的程序评估测试样品的抗病毒活性，例如噬菌斑测定，焦点测定和TCID 50测定。

第二部分：病毒感染性的测定＆nbsp;

病毒滴度以斑块形成单位（PFU）/ ml，聚焦形成单位（FFU）/ ml，细胞感染单位（CIU）/ ml和50％组织培养感染剂量（TCID <50> >）/毫升。

噬斑测定（用于SINV，VSNJV和EMCV）
噬斑测定是确定导致强细胞病变效应（CPE）的病毒的传染性滴度的标准方法之一。汇合的单层细胞用各种稀释度的病毒感染，并在含有琼脂糖或甲基纤维素的固体或半固体覆盖培养基中培养。这最大限度地减少了后续的病毒传播，只有单层中的相邻细胞。病毒感染的细胞通过CPE进行细胞死亡，并且将一组死细胞脱落的区域称为斑块（图2）。传染性滴度表示为PFU / ml。

图2. VSNJV的噬菌斑测定板的代表性图像通过用Gram Hacker的染色溶液I进行染色来显现噬菌斑。用10倍稀释系列（10-2-2）感染细胞单层， 10 -3 -3，-10 -4，10 -5和10 -6）和显示模拟感染。
1. 种子Huh7it-1细胞（5×10 5个细胞）在6孔板的每个孔中终体积为3ml完全培养基中。
2. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育20-24小时。（细胞应该是90-100％汇合。）
3. 为了制备病毒溶液，在900μl培养基（10 -1稀释度）中稀释100μl来自部分I的病毒-PLA 2（或中和抗体）混合物并随后制备10倍系列稀释的病毒（10 -2 -2至10 -6稀释度）。
4. 移除每口井的培养基
5. 将细胞（300μl/孔）接种病毒溶液（10 -2 -2至10 -6稀释）。
6. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时。
7. 去除接种物并用培养基（3ml /孔）冲洗。
8. 轻轻地添加含有1％甲基纤维素（3毫升/孔）的覆盖介质。
  注意：覆盖媒体包含2％FBS。
9. 在37℃，5％CO 2培养箱中培养2至4天 - VSNJV和EMCV（2天），SINV（3至4天）。
10. 吸取重叠介质。
  注意：由于覆盖介质是粘性的，请慢慢吸入。
11. 在室温下用含10％甲醛的PBS（ - ）（1ml /孔）溶液固定细胞20分钟。
12. 添加革兰染色黑色染液I（1ml /孔）。
13. 孵育30分钟。
14. 弃去染色溶液，用PBS（3ml /孔）冲洗并干燥板。
15. 计数斑块的数量（图2）。
通过FA方法进行焦点形成测定（对于HCV，DENV，JEV，FLUAV，SeV，HSV-1，CV-B3）
焦点形成测定对于测量不会导致强CPE的病毒的传染性特别有用。将病毒感染的细胞温育一轮病毒生命周期（一步生长）。用FA方法检测病毒感染的细胞，使用对各病毒抗原特异性的抗体（图3）。
传染性滴度表示为FFU / ml或CIU / ml

图3.用FA法显示病毒感染细胞病毒感染细胞染成绿色。核被染成蓝色。比例尺= 10微米。
1. 在含有无菌玻璃浆的24孔板的每个孔中种入Huh7it-1细胞（每1ml含1×10 5个细胞）。
2. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育20-24小时。
3. 为了制备病毒溶液，在900μl培养基（10 -1稀释度）中稀释100μl来自部分I的病毒-PLA 2（或中和抗体）混合物并随后制备10倍系列稀释的病毒（10 -2 -2至10 -6稀释度）。
4. 移除每口井的培养基
5. 将病毒溶液接种到细胞（200μl/孔）。
6. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育1小时。
7. 去除接种物并用培养基（1ml /孔）冲洗。
8. 添加完整培养基（500μl/孔）。
9. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育24小时。
10. 去除培养基，并用PBS（200μl/孔）冲洗两次。
11. 用200μl4％多聚甲醛溶液固定细胞。
12. 在室温下孵育20分钟。
13. 用PBS（200μl/孔）冲洗细胞三次。
14. 加入200μl0.1％Triton X-100的PBS溶液。
15. 在室温下孵育20分钟。
16. 在PBS中加入200μl的1％BSA。
17. 在室温下孵育1小时。
18. 在PBS中制备一抗。
  注意：我们使用UV灭活的抗HCV人血清（1：500稀释），抗DENV PrM的兔多克隆抗体（1：500稀释），抗DENV 2型（1：500稀释）的小鼠单克隆抗体，兔抗CV-B3的抗血清（1：100稀释度），抗FLUAV的兔抗血清（1：1,000稀释），抗SeV的兔抗血清（1：1,000稀释度）和抗HSV-1的兔抗血清（1：1,000稀释）。
19. 删除1％BSA解决方案。
20. 添加针对相应病毒的一级抗体（200μl/孔）。
21. 在室温下孵育1小时
22. 在PBS中制备FITC偶联的二抗（1：800稀释，200μl/孔）。
23. 用PBS冲洗细胞三次。
24. 加入二抗（200μl/孔）。
25. 在室温下在暗箱中孵育1小时
26. 用PBS（500μl/孔）冲洗细胞三次。
27. 加入Hoechst 33342溶液（1 mg / ml），PBS（200μl/孔）
28. 在室温下孵育15分钟。
29. 用PBS（500μl/孔）冲洗细胞三次。
30. 使用Vectashield安装解决方案将玻璃盖玻片安装在显微镜载玻片上
31. 在荧光显微镜下观察并计数病毒感染（绿色染色）细胞的数量（图3）。
TCID 50测定法（对于DENV，JEV，HSV-1，SINV，VSNJV和EMCV）
TCID50测定可用于测量导致强CPE的病毒的感染性。 TCID 50表示使50％的测试孔显示细胞分离的病毒稀释度（图4）。感染滴度表示为TCID 50 / ml。

图4.TCID50测定结果的示意图白色圆圈表示由于强CPE而使细胞已经经历细胞死亡从而与塑料板分离的孔。蓝色的圆圈表示细胞保持完整，可以结晶紫染色的孔。
1. 在96孔板的每个孔中的完全培养基中接种Vero细胞（100μl中2×10 4个细胞）。
2. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育20-24小时。
3. 为了制备病毒溶液，在100μl培养基（2μl稀释液）中稀释100μl来自部分I的病毒-PLA 2（或中和抗体）混合物并且随后制备病毒的2倍连续稀释液（2〜2〜2〜10稀释）。
4. 从每个孔中取出培养基。
5. 将病毒溶液接种到细胞（100μl/孔）
  注：同一样本的等分试样应接种到4至8孔。
6. 在37℃，5％CO 2培养箱中培养2小时
7. 去除接种物并添加覆盖介质。
  注意：覆盖媒体包含2％FBS。
8. 在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育。
  注：DENV（5至8天），JEV（5至6天），HSV-1和SINV（4天），VSNJV和EMCV（2天）。
9. 在倒置显微镜下计数有或没有CPE的孔数。
10. 去除培养基并用PBS（100μl/孔）冲洗。
11. 在室温下用含10％甲醛的PBS溶液（ - ）（100μl/孔）固定细胞20分钟。
12. 用PBS（100μl/孔）冲洗细胞。
13. 每孔加入结晶紫溶液（100μl/孔）
14. 在室温下孵育10分钟。
15. 丢弃结晶紫溶液，用PBS（100μl/孔）冲洗，并干燥板。
16. 用肉眼计数有或没有CPE的孔数（图4）。
阴性染色电镜分析（HCV，DENV，JEV，FLUAV，SeV，HSV-1，CV-B3，SINV，VSNJV和EMCV）

病毒的阴性电子显微镜检查需要足够浓度的病毒颗粒（> 10 8 / ml）。
1. 将5至10μl的纯化病毒溶液加入Formvar涂层的镍网格中。
2. 在室温下等待5分钟，以使病毒颗粒吸附在电网上。
3. 使用滤纸条的尖端去除溶液。
4. 在蒸馏水中加入5至10μl2％磷钨酸到电网上并孵育2分钟。
5. 使用一张滤纸去除溶液。
6. 加入10μlPBS清洗电网。（重复步骤D5和D6三次。）
7. 风干网格。
8. 透射电子显微镜下观察。

数据分析

基于对连续稀释介导的病毒感染性的抑制百分比，可以获得针对给定病毒的50％抑制浓度（IC 50：IC 50）的抗病毒物质的IC50的抗病毒物质。该模型可用于药理研究中的典型剂量反应曲线和受体 - 配体结合测定。

使用ImageJ软件绘制数据并绘制S形曲线（图5）。
四个参数（A，B，C，D）对数方程得到。
y = D +（A-D）/（1 +（x / C）^ B）
A =最小渐近线; B =斜率因子; C =与A和D之间的响应对应的浓度; D =最大渐近线。
参数C被计算为IC 50的估计值。＆nbsp;

的图5示出了由一种抗病毒药物的连续稀释病毒感染的抑制的典型S形曲线。红线表示的IC <子> 50 药物的价值。

笔记

感染性病毒的操作需要特殊的生物安全实验室。根据进行研究的国家/地区的法律修改生物防护程度。

食谱

完成Dulbecco改良的Eagle's培养基（完全培养基）
1个非必需氨基酸
100U / ml青霉素和链霉素
10％胎牛血清（FBS;在56℃热灭活30分钟）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 溶解NaCl（80g），KCl（2g），Na 2 HPO 4·12H 2 O（28.8g）和KH 2 （2.4g）在800ml H 2 O中的溶液
2. 使用dH 2 O
  将音量调节至1 L
3. 在121℃高压灭菌20分钟。用蒸馏水稀释至1x
覆盖媒体
1. 在100°C的高压灭菌玻璃瓶中加热DMEM（500毫升）
2. 把磁棒放在瓶子里
3. 将甲基纤维素（5克）加入到热DMEM（500毫升）中并充分搅拌
  注：甲基纤维素尚未溶解（混浊）。
4. 在121°C高压灭菌20分钟
5. 当含1％甲基纤维素的DMEM的温度下降到约60℃时（溶液仍然浑浊），用冰浴迅速冷却瓶子，同时用磁力搅拌器搅拌内容物。甲基纤维素开始溶解，介质变成半透明
6. 添加FBS和其他必需的细胞培养试剂

致谢

这项工作得到了卫生，劳动和福利部以及日本医学研究和开发署（AMED）对病毒性肝炎研究的资助。这项工作也得到了东京都政府特别研究登革热疫苗开发援助的部分支持。该协议是根据Chen等人发表的程序改编的。作者没有任何利益冲突或利益冲突声明。

参考

Apriyanto，DR，Aoki，C.，Hartati，S.，Hanafi，M.，Kardono，LB，Arsianti，A.，Louisa，M.，Sudiro，TM，Dewi，BE，Sudarmono，P.，Soebandrio，A.和Hotta，H。（2016）。龙眼粗提物的抗丙型肝炎病毒活性（ Dimocarpus longan Lour。）leaves。 Jpn J Infect Dis 69（3）：213-220。
（2009年），Bungyoku，Y.，Shoji，I.，Makine，T.，Adachi，T.，Hayashida，K.，Nagano-Fujii，M.，Ide，Y. H.，Deng，L.and Hotta，H。（2009）。在培养的肝癌细胞中高效生产具有适应性突变的传染性丙型肝炎病毒 J Gen Virol 90（Pt 7）：1681-1691。
Chen，M.，Aoki-Utsubo，C.，Kameoka，M.，Deng，L.，Terada，Y.，Kamitani，W.，Sato，K.，Koyanagi，Y.，Hijikata，M.，Shindo，K 。，Noda，T.，Kohara，M.和Hotta，H。（2017）。广谱抗病毒药物：分泌型磷脂酶A 2靶向病毒包膜脂质双层来源于内质网膜。 Sci Rep 7（1）：15931.
El-Bitar，A.M.，Sarhan，M.M.，Aoki，C.，Takahara，Y.，Komoto，M.，Deng，L.，Moustafa，M.A。和Hotta，H。（2015）。埃及蝎子毒液对丙型肝炎病毒的蛇毒活性 Virol J 12：47.
Hayashi，T.，Hotta，H.，Itoh，M。和Homma，M。（1991）。蛋白酶抑制剂抑肽酶对致命性仙台病毒肺炎的保护作用 < J Gen Virol 72（Pt 4）：979-982。
Hayashi，K.，Iwasaki，Y。和Yanagi，K。（1986）。单纯疱疹病毒1型引起的小鼠脑积水。 J Virol 57（3）：942-951。
Holthausen，DJ，Lee，SH，Kumar，VT，Bouvier，NM，Krammer，F.，Ellebedy，AH，Wrammert，J.，Lowen，AC，George，S.，Pillai，MR和Jacob，。两栖动物宿主防御肽对携带人类H1血凝素的流感病毒具有杀病毒作用。 Immunity 46（4）：587-595。
Hotta，H.，Wiharta，A. S.和Hotta，S。（1984）。在小鼠巨噬细胞系Mk1和Mm1中抗体介导的登革病毒感染增强 Proc Soc Exp Biol Med 175（3）：320-327。
Scheel，T.K。和Rice，C.M。（2013）。了解丙型肝炎病毒的生命周期为高效疗法铺平了道路。 Nat Med 19（7）：837-849。
Shimizu，Y.K。，Hijikata，M.，Oshima，M.，Shimizu，K.，Alter，H.J.，Purcell，R.H.，Yoshikura，H。和Hotta，H。（2013）。分离针对丙型肝炎病毒包膜e2蛋白的人单克隆抗体及其特性。 PLoS One 8（2）：e55874。
Shimizu，K.，Mukaigawa，J.，Oguro，M.，Ono，Y.，Nakajima，K。和Kida，H。（1985）。抗血凝素体外抑制A型流感病毒的转录酶活性抗体。