材料和试剂

μ-Plate 96孔（ibidi，目录号：89626）
无菌无RNase微量离心管（Thermo Fischer Scientific，目录号：AM12400）
不含DNA酶和RNase的无菌移液吸头（例如，Sorenson Bioscience，目录号：10350）
手套（，无粉丁腈手套，MICROFLEX，目录号：XC-310）
巨噬细胞
可以使用的巨噬细胞类型是细胞系，如RAW 264.7（ATCC，目录号：TIB-71）和原代巨噬细胞如C57BL / 6骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）。
细胞培养基
将RAW294.7细胞系维持于补充有10％热灭活胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11965） Gibco TM，目录号：10082147）。
CleanCap TM EGFP mRNA（TriLink BioTechnologies，目录号：L-7601）
TransIT™-mRNA转染试剂盒（Mirus Bio，目录号：MIR 2250）
OptiMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985062）
RNaseZap TM（Sigma-Aldrich，目录号：R2020）
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，目录号：AM1345）
MEGAClear TM Transcription Clean-Up Kit（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，产品目录号：AM1908）
分子生物学级水（康宁，目录号：46-000-CI）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16140071）
青霉素和链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
BglII限制性核酸内切酶（New England Biolabs，目录号：R0144S）
NEBuffer 3.1（新英格兰生物实验室，目录号：B7203S）
南极磷酸酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0289S）
南极磷酸酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0289S）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
Gateway TM TM pcDNA -DEST47载体（Thermo Fischer Scientific，目录号：12281010）
琼脂糖（LE琼脂糖，GeneMate，目录号：E-3120-500）
10倍MOPS缓冲液（Fischer Scientific，目录号：BP2900500）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
RNA Millennium Markers（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM，产品目录号：AM7150）
RNA凝胶上样染料（Thermo Fischer Scientific，目录号：R0641）
甲醛溶液（37％，Sigma-Aldrich，目录号：252549）
质粒线性化反应混合物（见配方1）
EGFP mRNA转染反应混合物（见配方3）
聚（A）尾矿反应混合物（见第4条）
RNA变性凝胶电泳（见方法5）
mRNA体外转录反应混合物（见第6部分）
DMEM完全培养基（见第7章）

设备

P20 Pipetman（Gilson，目录号：F123600）
P200 Pipetman（Gilson，目录号：F123601）
P1000 Pipetman（Gilson，目录号：F123602）
多通道移液器（Eppendorf，目录号：3125000044）
组织培养CO 2培养箱
组织培养罩
水浴
-20°C冷冻机
Epifluorescence显微镜（例如，Nikon，型号：Eclipse Ti-E，配备60x; Plan-Apochromat，NA 1.4油浸物镜，Ti Z驱动器，高分辨率单色电荷耦合器件（CCD）数码相机; Photometric Cool SNAP HQ2以及适用于DAPI，FITC和TexasRed通道的适当滤光片组）。
Eppendorf Thermomixer®C（Eppendorf，型号：ThermoMixer®C，目录号：5382000023）
NanoDrop分光光度计
琼脂糖凝胶电泳系统

软件

尼康成像软件 - 元素高级研究（NIS-Elements）版本4.40

程序

体外mRNA转录
注意：有多种方法可以获得目的基因的mRNA。可以使用含有RNA聚合酶结合位点的PCR扩增DNA或线性化质粒DNA（McLenachan等，2013）。或者，mRNA可以商业购买。在这里，我们使用具有T7启动子和聚腺苷酸化位点的质粒pcDNA-DEST47-CpsA-GFP描述体外mRNA转录（Koster等，2017）。

质粒DNA的线性化
1. 使用限制性内切核酸酶BglII在50μl的总反应体积中在37℃下使质粒DNA线性化2h（参见下面的方案1）。
  备注：
  1. 可以从存在于质粒中的多种限制性位点中选择线性化。例如，在这种情况下，也可以使用XmaI代替BglII。质粒线性化应优选使用限制性内切酶完成，所述限制性内切酶导致目标基因下游的平端或5'突出端。温育的温度和持续时间取决于使用的限制酶。
  2. 从足够量的质粒DNA开始考虑样品损失。例如，3μg质粒产生〜2.5μg最终纯化的线性产物。
  3. 限制酶的热灭活必须在完成质粒消化后进行。温度/时间取决于使用的酶。在不可能的情况下，例如BglII，立即进入下一步。
2. 向上述溶液中加入南极磷酸酶反应缓冲液和南极磷酸酶（每μg质粒1单位）使终体积为60μl（见下面的方案2）。
  注意：这一步对线性化质粒的5'和3'磷酸化末端去磷酸化很重要，并防止重新连接。
3. 将上述反应混合物在37℃孵育1小时。
4. 在80°C加热灭活南极磷酸酶2分钟。
5. 使用PCR纯化试剂盒（QIAquick PCR Purification Kit，QIAGEN）从上述反应混合物中纯化线性化的质粒DNA，并通过在260nm处测量吸光度来定量产物。
6. 使用1％琼脂糖凝胶电泳通过与未切割质粒比较来确认质粒线性化（图1）。
  注意：确认质粒已被线性化是重要的，因为未切割的质粒DNA的存在将显着降低所需mRNA产物的产量。如果有未切割的质粒污染，可以使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）从琼脂糖凝胶中纯化线性化的质粒条带。或者，可以重新优化步骤A1的条件。
  
  图1.具有1kb DNA梯（＃1），未切割和线性质粒（＃3,4）的琼脂糖凝胶
  
  mRNA转录反应
  注意：
  1. 根据制造商的方案解冻质粒DNA和mRNA转录试剂盒试剂。涡旋并旋下小瓶以确保均匀的溶液。
  2. 这里使用的试剂盒描述了合成mRNA在300-55kb范围内的mRNA的反应步骤。但是，该协议已针对〜8 kb产品进行了优化。＆nbsp;
7. 通过在无核酸酶的水中稀释线性质粒，2×NTP / ARCA缓冲液，10×反应缓冲液和T7酶来组装20μl转录反应物（参见下面的方案3）。反应混合物应在室温下进行。
  注意：该试剂盒添加了一种新型帽子类似物，称为抗反帽子类似物（ARCA），可确保mRNA正确覆盖方向。
8. 通过轻轻地上下移液来充分混合内容物。
9. 在37℃孵育反应混合物2小时。
10. 向上述反应混合物中加入1μlTurbo DNase，37℃孵育15分钟。
  注意：添加脱氧核糖核酸对于消除最终产品中的DNA污染很重要。＆nbsp;
  
  聚（A）加尾反应
11. 向上述20μl转录反应中加入5x E-PAP缓冲液，MnCl 2溶液，ATP溶液和无核酸酶水，使终体积为96μl（参见下面的方案4）。
12. 取出该反应混合物的2.5μl等分试样并将其存储起来，以便在步骤A18中稍后使用。
13. 加入4μlE-PAP酶，通过上下移液轻轻混合。
14. 将反应混合物在37°C孵育45分钟。
15. 根据制造商的说明使用MEGAClear试剂盒纯化mRNA产物
16. 通过在260nm处测定吸光度来量化mRNA。
  注意：
  1. 将转录的mRNA在分开的不含RNase / DNase的试管中等分。它们可以在-20°C保存数月或-80°C保存数年。
  2. 使用上述方法可从1μg线性质粒获得60μgmRNA。＆nbsp;
17. 应进行RNA变性凝胶电泳以评估转录mRNA的质量。准备50毫升1％琼脂糖凝胶，加入0.5克琼脂糖在36毫升双蒸水中煮沸。加入5ml 10x MOPS缓冲液和9ml甲醛（37％）。加入终浓度为0.5μg/ ml的溴化乙锭（见下面的5）。
  备注：
  1. 甲醛应在化学通风柜内处理。不要用甲醛煮沸琼脂糖溶液。
  2. 溴化乙锭是已知的诱变剂，因此小心处理很重要。也可以使用更安全的替代品，如SYBR安全染料（Invitrogen）。
18. 在2x RNA加载染料中稀释来自步骤A12和A16的RNA标记和RNA样品并在75℃煮沸10分钟。
19. 加载RNA样品并以〜5伏特/厘米的速度在1x MOPS缓冲液中运行凝胶。在UV照射下可视化RNA条带（图2）。＆nbsp;
  
  图2.具有RNA梯（＃1），CAT-GFP mRNA（＃2）之前和聚（A）尾随（＃3）以及CpsA-GFP mRNA之前（＃4）和聚（ A）拖尾（＃5）
20. 按照程序B所述用体外转录的mRNA转染RAW 264.7巨噬细胞。
21. 样品可以在24-72小时后分析。我们在转染后24小时进行了吞噬作用测定（Koster等人，2017）。
  注意：
  1. 建议平行设置转染EGFP mRNA作为转染效率的阳性对照。增强和转染试剂单独使用，无mRNA，不是有用的阴性实验对照。未配合的试剂可能导致细胞毒性。一个适当的实验控制将取决于具体的研究。我们在pcDNATM-DEST47载体中使用氯霉素抗性基因（CAT）将CAT-GFP mRNA作为对照（图2）。
  2. 该方法导致巨噬细胞中瞬时蛋白质表达。蛋白质表达的持续时间将取决于所分析的特定蛋白质的周转率。如果需要更长的实验持续时间，用户可以在48小时后重新转染巨噬细胞。
使用EGFP mRNA标准化巨噬细胞转染
1. 以15,000个细胞/孔的密度在96孔黑板（μ-Plate 96孔，ibidi，GmbH）中种子RAW264.7巨噬细胞。将细胞在37℃，5％CO 2气氛下加湿培养箱中孵育。
  注意：该协议也可以适用于其他格式。巨噬细胞接种密度取决于细胞的复制速率以及实验的持续时间。
2. 第二天，使用Mirus TransIT mRNA转染试剂盒用EGFP mRNA转染巨噬细胞。首先将mRNA转染试剂盒（Boost试剂和转染试剂）和OptiMEM的内容物置于室温下。
  注意：请勿将助推试剂或转染试剂置于冰上或水浴中。
3. 在冰上融化EGFP mRNA 备注：
  1. 为了保持mRNA的完整性，请始终在冰上解冻mRNA，避免反复冻融。建议制备等分的mRNA溶液。
  2. 必须非常谨慎地执行RNA工作。清洁工作场所并喷洒RNaseZap以防止RNase污染。务必戴上手套并定期更换。总是使用无核酸酶的提示和管进行RNA工作。
4. 在转染巨噬细胞之前，取出培养基并用150μl新鲜完全培养基代替。
  将细胞送回孵化器
5. 通过在40μlOptiMEM中稀释2μlEGFPmRNA（100μg/ ml储备液）来制备每孔50μlmRNA转染混合物（参见下面的配方6）。轻轻地上下吹打混匀。
  注：描述的体积用于转染200ng EGFP mRNA。建议根据所使用的实验细胞类型和条件，使用一定范围的mRNA量（例如100,200和500ng）进行标准化。
6. 以每微升2微升的mRNA添加Boost试剂到上述溶液中。轻轻地上下吹打混匀。
7. 将转染试剂以2μl/μgmRNA加入到上述溶液中。
  轻轻地上下吹打混匀。
  注意：在开始试验之前，可以在OptiMEM中稀释Boost和转染试剂。但是，它们必须新鲜稀释，不应储存以备后用。在此方案中使用2μlBoost /转染试剂/μgmRNA的比例，但可以根据细胞类型和组织培养板格式修改此比例。
8. 在室温下孵育转染混合物3-5分钟。
  注意：这是关键的一步。孵育时间超过5分钟可能会降低转染效率。
9. 将mRNA转染溶液的每孔50μl滴入巨噬细胞培养物中。来回摇动盘子，轻轻地左右摇晃以确保适当的混合。
10. 在组织培养箱中孵育转染的巨噬细胞过夜
11. 第二天，使用荧光显微镜观察GFP转染的细胞，使用488nm激发和530nm发射（FITC通道）的过滤器组。注意：可以使用标准方法评估细胞活力，例如用Alamar蓝或台盼蓝染料（Thermo Fischer Scientific）染色。对于此处所述的方案，当使用500ng mRNA转染时，细胞活力下降。另外，可以进行实验室特定的免疫激活试验。＆nbsp;

数据分析

为了量化荧光细胞中的EGFP信号（步骤B11，图3），下面使用NIS-Elements版本4.40描述基本工作流程。

图3.GFP在RAW264.7巨噬细胞中的表达用200ng EGFP mRNA转染细胞。 A.使用荧光显微镜观察EGFP荧光细胞。 B.细胞的明场图像。比例尺= 20μm。

在软件中打开EGFP阳性细胞的图像，然后单击图像边界右侧的感兴趣区域（ROI）图标。选择一个选项以在图像中的单元格周围绘制ROI。例如，我选择了3个具有不同GFP强度的ROI（图4）。
注意：大多数图像分析软件都有类似的选项，您也可以将它们用于图像分析。例如，ImageJ具有“矩形”，“椭圆形”和“多边形”选择选项。

图4.选择用于EGFP强度分析的ROI 。针对GFP强度分析在单个细胞周围绘制ROI。
右键单击NIS-Elements桌面并选择“分析控件”。选择'ROI统计'选项。
该软件将计算每个选定ROI的平均荧光强度（MFI）（图4）。在ROI统计窗口中选择“导出”选项，将数据导出到Excel工作表中。
应用相同的方法获得未转染样品中细胞的MFI。计算这组值的平均值。这将估计自发荧光。
使用公式计算转染效率：

注意：使用描述方案获得的转染效率为60-70％。

食谱

质粒线性化反应混合物
南极磷酸酶反应混合物
mRNA体外转录反应混合物

*在mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit中提供
聚（A）尾矿反应混合物

*在mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit中提供
RNA变性凝胶电泳
EGFP mRNA转染反应混合物

**在Mirus TransIT®-mRNA Transfection Kit中提供
DMEM完全培养基

培养基应该是无菌的，用于组织培养。可以用青霉素和链霉素（Gibco）将细胞维持在完全培养基中。

致谢

这项工作由美国国立卫生研究院/ NIAID（R01 AI087682,1R01 AI130454和R21 AI128427），Potts纪念基金会和圣路易斯医学院华盛顿大学资助。作者没有利益冲突。该方案用于Koster等人（2017）报道的研究。

参考

Koster，S.，Upadhyay，S.，Chandra，P.，Papavinasasundaram，K.，Yang，G.，Hassan，A.，Grigsby，SJ，Mittal，E.，Park，HS，Jones，V.，Hsu， FF，Jackson，M.，Sassetti，CM和Philips，JA（2017）。结核分枝杆菌受到NADPH氧化酶和LC3相关吞噬作用的保护LCP蛋白CpsA。美国国家科学院院刊114（41）：E8711-E8720。
McLenachan，S.，Zhang，D.，Palomo，A.B.，Edel，M.J。和Chen，F.K。（2013）。 mRNA转染小鼠和人类神经干细胞培养物 PLoS One 8（12）：e83596。
Van De Parre，T. J. L.，Martinet，W.，Schrijvers，D. M.，Herman，A. G.和De Meyer，G. R. Y.（2004）。在J774A.1巨噬细胞中有效转染mRNA而不是质粒DNA。 Biochem Biophys Res Commun 327：356-360。
Zhang，X.，Edwards，J.和Mosser，D。（2009）。外源性基因在巨噬细胞中的表达：障碍和机会 In：Reiner，N 。（Ed。）巨噬细胞和树突状细胞。分子生物学方法（Methods and Protocols）。第531页。 Humana Press 。