材料和试剂

纱布海绵（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：22-415-468）
21 G针头
3毫升注射器
70微米过滤器（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：22-363-548）
1.5ml微量离心管（NEST Biotechnology，目录号：615601），15ml试管（BioExpress，GeneMate TM，目录号：C-3394-1）和50ml锥形管（BioExpress，GeneMate TM ，产品目录号：C-3394-4）
其他抗体：
APC抗CD31（Thermo Fisher Scientific，eBioScience TM，目录号：17-0311-82）
PE-anti-CD51（BD，BD Pharmingen TM，目录号：551187）
PE-Cy7-抗-CD45（BD，BD Pharmingen TM，目录号：552848）
生物素-Sca1（BD，BD Pharmingen TM，目录号：553334）
链霉亲和素APC-Cy7（BD，BD Pharmingen TM，目录号：554063）
CXCL12检测抗体：H / M CXCL12 / SDF-1荧光素（FITC）MAb（克隆79018）（R＆amp; D Systems，目录号：IC350F）
70％（v / v）乙醇
Hank平衡盐溶液（HBSS; 1x）（GE Healthcare，Hyclone TM，目录号：SH30588.02）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
I型胶原酶（Worthington，Lakewood，NJ）
DMEM（ATCC ，产品目录号：30-2002 TM）
具有BD GolgiStopTM（BD，BD Cytofix / Cytoperm™Plus，产品目录号：554715）的固定/透化溶液套件
HBSS染色缓冲液（见食谱）

设备

移液器
剪刀
镊子
弧形钳
台式离心机（SORVALL Legend RT）
血细胞计数器
FACSAria I

程序

从长骨准备单细胞悬液和成骨细胞分选
1. 通过CO 2窒息安乐死小鼠并证实颈椎脱臼致死。
2. 用70％（v / v）乙醇消毒身体。
3. 用剪刀和镊子在后肢和躯干之间连接切口。通过向爪的切割位置拉动，将整个皮肤从后肢移除（图1A）。使用解剖剪刀和弯钳，小心地去除长骨（股骨和胫骨）上的所有肌肉。切开长骨并转移到无菌纱布上。
4. 尽可能彻底地清洁软组织（图1B）。
  
  图1.制备小鼠长骨A.暴露后腿。 B.清除附着的肌肉后清理长骨（胫骨和股骨）。
5. 切掉骨骺。
6. 用1 ml冷HBSS（补充有0.5％BSA）填充21号针头和3 ml注射器，并使用注射器冲洗骨髓（BM）三次（图2A）。
7. 用剪刀将骨切成约1-2mm2的小块（图2B）。
  
  图2.长骨碎片的制备A.清洗骨髓后清理长骨; B.准备好的骨碎片。
8. 在37℃下通过振荡（110rpm）在50ml锥形管中补充胶原酶I（3mg / ml，在DMEM中）的2ml HBSS缓冲液中从每组2只胫骨和股骨获得消化骨碎片1小时。
9. 加入3体积的补充有10％FBS的DMEM（6ml）以终止胶原酶I活性。
10. 将细胞溶液通过50毫升锥形管中的70μm过滤器过滤。
11. 在250℃旋转5分钟，在4℃下进行5分钟。
12. 去除上清液
13. 用2ml HBSS缓冲液洗涤细胞，并在4℃下以250-400gxg的速度旋转5分钟。
14. 弃去上清液并将细胞重悬于1ml HBSS缓冲液中。
15. 确定细胞数量。用血细胞计数器计数细胞。
16. 在4℃下，以250-400×g 速度旋转5分钟。
17. 细胞已准备好用于成骨细胞分选和CXCL12染色。
18. 使用以下抗体制备HBSS缓冲液中的抗体混合物：FITC谱系标记（T细胞：CD4，CD8; B细胞：B220;红细胞：Ter119;粒细胞和单核细胞：CD11b和Gr-1），APC-CD31（内皮细胞），PE-CD51，PE-Cy7-Sca1。使用100μl含有1μl每种抗体的HBSS缓冲液用于1×10 6个细胞。
19. 将抗体混合物中步骤A17的细胞重悬于冰上20分钟。
20. 用200-500μl冷HBSS缓冲液洗涤细胞各两次，在4℃在洗涤之间在250-400×g下旋转5分钟。
21. 用FACSAria I对细胞进行分选。通过门控lin-sup（CD4，CD8，B220，Ter119，CD11b，Gr-1）CD31 - CD51 + Sca1 - 人口（图3A和3B）。
  
  图3.对成骨细胞的分选A. lin-sup的选择策略（CD4，CD8，B220，Ter119，CD11b，Gr-1）CD31 - / - 人口; B.门控成骨细胞（lin-CD31-CD51 + Sca1-）。
CXCL12 / SDF-1细胞内染色

在15ml Falcon管中重悬步骤A的步骤A17的HBSS缓冲液中的细胞。加入生物素-Sca1抗体并在冰上放置细胞20分钟。使用100μl含有0.5μl抗体的HBSS缓冲液用于1×10 6个细胞。
用200-500μlHBSS缓冲液洗涤细胞两次。
在250℃旋转5分钟，在4℃下进行5分钟。在HBSS缓冲液中重悬细胞并加入APC-CD31，PE-CD51，PE-Cy7-CD45和链霉亲和素APC-Cy7抗体，然后在冰上孵育20分钟。
每次用1 ml HBSS缓冲液洗两次。将细胞以250×g离心5分钟。
通过将细胞重悬于250μlFixation /透化溶液（包含在BD Cytofix / Cytoperm TM Plus中）在4℃下15-20分钟来固定和透化细胞。
注意：在添加Fixation / Permeabilization解决方案之前，可以通过轻轻涡旋来避免细胞聚集。
用1ml的1x Perm / Wash TM溶液（包含在BD Cytofix / Cytoperm TM Plus中）洗涤细胞两次，通过在250μgxg 在4℃下5分钟，并除去上清液。
注意：在洗涤步骤中需要Perm / Wash TM TM溶液以保持细胞处于透化状态。 />
通过在90μl1x Perm / Wash TM溶液中加入10μlFITC-CXCL12染色细胞内CXCL12并轻轻涡旋。
在室温下孵育细胞30分钟
用1ml 1x Perm / Wash TM缓冲液洗涤细胞两次。
在250°C下将细胞旋转5分钟
将细胞重悬于200μlHBSS缓冲液中进行流式细胞分析（见下图4）。
注意：对于阴性对照，一组单独的细胞应该用同种型对照抗体染色。

数据分析

从野生型（WT）小鼠长骨中，在用胶原酶I短暂消化后，成骨细胞容易从骨髓基质分离（图4A）。相比之下，在由活化的Notch1驱动的T-ALL小鼠的骨髓基质中成骨细胞减少（图4B）。通过细胞内染色和流动分析的CXCL12表达显示与正常对照相比，白血病小鼠成骨细胞减少52％（图4C）。

图4.骨髓成骨细胞的分选和CXCL12染色从WT或白血病发展小鼠制备骨髓基质细胞。骨髓成骨细胞（OB）（lin-CD31-CD51 + Sca-1-t）的染色（A和B）通过选择谱系 - CD31 - 弹出窗口。通过使用同种型对照或抗CXCL12抗体（C）的平均荧光强度（MFI）显示CXCL12的细胞内表达。

食谱

HBSS染色缓冲液
Hank平衡盐溶液（HBSS; 1x）补充0.5％BSA

致谢

这项工作得到了美国癌症协会LIB-125064（L. Zhou）和NIH HL103827（L. Zhou）的资助。没有披露任何潜在的利益冲突。

参考

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