材料和试剂

Fontainebleau砂（VWR，目录号：VWRC27460.295）
乳胶手套
2 ml微量离心管（Dominique DUTSCHER，目录号：033297）
5毫米钢珠（Brammer）
500毫升洗瓶
96孔板（VWR，目录号：735-0083）
10,20,200和1,000微升的提示
纸巾
水稻种子，包括控制种质（易感，部分和高度抗性）
感染RYMV的水稻叶片（新鲜，干燥或在-20°C冷冻）
碳化硅0.037毫米用作磨料（VWR，目录号：22540.298）
液氮（如果可能的话）
RYMV抗体（针对纯化的RYMV病毒粒子的宽谱多克隆抗体 - 按照N'Guessan等人（2000）和Afolabi等人（2009）或DSMZ ，产品目录号：AS-0732或RT-0732）
针对RYMV的碱性磷酸酶共轭多克隆抗体（按Clark和Adams（1977）或DSMZ，目录号：RT-0732所述制备）
脱脂奶粉
底物pNPP（对硝基苯基磷酸酯，Sigma-Aldrich，目录号：N9389）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40），MW 40000（VWR，目录号：26616.184）
磷酸钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
MilliQ水
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S7795）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
二乙醇胺（Fisher Scientific，目录号：10131470）
盐酸（HCl）10 N
磷酸盐接种缓冲液（0.1 M pH 7.2）（见食谱）
ELISA检测缓冲液（见食谱）

缓冲PBST 10x
包被缓冲液pH9.6

底物缓冲液pH值9.8（见食谱）

设备

温室或植物生长室
灰泥和杵
组织裂解液（QIAGEN，型号：TissueLyser II）
10,20,200和1,000μl容量移液器
200μl容量的8通道移液器
涡流
pH计
微量离心机
带有405纳米过滤器的微孔板读取器（TECAN，型号：Infinite M200 Pro）

程序

植物和病毒制备

在整个实验过程中，在下列温室条件下种植水稻 - 大约12小时光照，28±1℃（天）和25±1℃（夜间），以及75％相对湿度。接种2周后（WAI），在2至3叶发育阶段（图1）进行接种。
在土壤中施用合适的肥料以获得最佳生长。

图1.两周龄的IR64植株，准备接种
使用以下推荐的水稻品种作为支票：IR64，Bouake 189或BG90-2（易感的水稻品种）; Azucena或Moroberekan（部分抗性苜蓿对照）;具有任何高抗性基因的材料（RYMV1，RYMV2，RYMV3，Thiémélé等人，2010; Orjuela等人，2013; Pidon等人，2017）（抗性对照）。
在任何敏感的对照材料中繁殖RYMV分离株 - 强烈建议始终使用相同的材料。机械地接种植物（如下所述），当症状达到5至7级严重程度（症状严重程度如下所述）时以3 WAI收获叶子。受感染的叶子可能会保存在-20°C几个月或几年。

接种
1. 切割RYMV感染的叶子，将其用作0.5-1cm片段的接种物来源。加枫丹白露沙（约200毫克到1克叶）。用0.1M磷酸盐接种缓冲液（pH7.2）（10ml缓冲液至1g叶片）研磨混合物（配方1;参见视频1）。
  每个植物至少需要100μl的接种物。
  
  视频1
2. 加两片碳化硅，并用杵混合。
3. 使用手套，如视频2所示，用地面接种物揉搓两次。保留至少5个敏感支票品种作为未接种的对照。
4. 5分钟后，用水冲洗叶片以除去多余的碳化硅（见视频2）。
  
  视频2
症状观察
1. 当症状首先出现在敏感对照植物上时，观察症状可在接种后10至15天（DAI）开始。日常出现症状的日期可以在每个工厂进行监测。在新出现的叶子上观察到症状。
2. 叶片的症状严重程度（图2）源自水稻标准评估系统（IRRI，2002），但不考虑植物高度和延迟开花的降低：
  1 =叶绿色（无明显症状）;
  3 =叶子绿色，但有点稀疏或条纹;
  5 =留下绿色或淡绿色斑点;
  7 =叶子呈淡黄色或黄色;
  9 =叶子变成橙色或者表现出坏死，有时会死亡。
  
  图2.水稻叶片的症状严重程度
DAS-ELISA
最后收获的样品在10至15天之间出现。样品可以新鲜使用，在-20°C快速冷冻，或在植物标本中干燥。
用组织裂解器（QIAGEN）进行样品制备时，将25毫克新鲜材料（或10毫克干燥材料）放入带有金属珠的2毫升试管中。将管放入液氮中5分钟。以30Hz的振荡频率在组织裂解器中研磨30秒。加入500μl1x PBST。剧烈旋涡。或者，用500μl1x PBST研磨相同数量的样品，用研杵和研钵研磨，然后转移至2 ml管中。在5,200×gg下离心5分钟。在将样品用于ELISA测试之前，将样品保持在4℃下24小时或在-20℃下冷冻。

涂料
将包被缓冲液（配方2）中纯化的RYMV病毒粒子的抗体稀释至浓度为1μg/ ml IgG或按供应商推荐的稀释倍数。每孔加入100μl抗体溶液，除了应填充的板边缘的孔中以避免边缘效应。将盖板盖上盖子，在潮湿的环境（湿纸巾盒）中37°C孵育2小时。
洗涤
丢弃孔中的涂层溶液。用1x PBST用洗瓶填充孔板并立即倒出洗涤缓冲液（快速洗涤）或3分钟后洗涤平板。继续进行快速洗涤和3次3分钟洗涤。清除纸巾上残留的缓冲液（视频3）。

视频3
阻挡
每孔加入1μlPBST中的200μl3％（3×100ml）脱脂牛奶。盖上培养板并在37°C孵育1小时。
洗涤
弃去溶液，用1x PBST洗3分钟。清除纸巾上的残留缓冲液。
抗原的保存
向孔中加入100μl样品上清液。盖上平板并在37℃孵育2小时。在样品中始终包括阳性对照（通常是RYMV接种物）和阴性对照（单独的PBST缓冲液和未接种的植物）。
两个对照和样本的技术重复
洗涤
弃去孔中的样品溶液，并在纸巾上除去残留的样品溶液以避免井间污染。
按照上述步骤C2所述继续用1x PBST清洗并去除纸巾上残留的缓冲液。
添加酶结合抗体
根据提供者的推荐或根据Hill等人（1981）实验确定的在1x PBST中稀释与碱性磷酸酶缀合的RYMV的抗体。每孔加入100μl结合抗体溶液。覆盖平板并在37°C孵育2小时。
洗涤
继续按上述步骤C2所述进行清洗。
添加基材
将pNPP片剂溶解在底物缓冲液中（1mg / ml;方案3）。由于pNPP是对光敏感的，所以要尽可能小心保持在黑暗中。每孔加入100μl底物溶液。在黑暗中和室温下孵育1小时。
在酶标仪上读取405 nm处的光密度（OD）。

数据分析

症状严重程度

易感品种IR64一般产生10〜15 DAI的第一症状，严重性指数在新出现的叶片上迅速达到7或9。部分抗性品种Azucena在IR64发生后大约一周出现症状，并且通常达到5的严重性指数。这两个品种通常显示清晰的斑点。相反，其他行，尤其是 O。 glaberrima 品种可以显示较少的特异性症状，这些症状可能难以与由非生物胁迫引起的萎黄病区分开来。高抗品种，如Gigante，Tog5681，Tog7291或Tog5307（Ndjiondjop等人，1999;Thiémélé等人，2010; Orjuela等人， / ，2013; Pidon et al。，<2017>），除非使用抗性破坏的分离株作为接种源或在抗性突变株出现实验。然而，在短期实验中，电阻分解的出现通常仅限于少数植物。因此，建议停止对WAI症状的观察以减少耐药性分解病例的发生。图3显示了整株植物的RYMV症状及其对植物发育的影响。

图3.整个稻株上RYMV的症状A.接种后一个月，接种IR64植株（左）与未接种IR64对照（右）比较。 B-d。具有不同抗性水平的植物：具有症状严重性指数为1（B）的高抗性植物;症状严重程度指数为5（C）的易感植物;症状严重程度指数为7（D）的易感植物。
与其他植物/病毒病理系统可观察到的情况相反（Ouibrahim等人，2014; Poque等人，2015），RYMV的机械接种是高效的 - 预计所有易感或部分抗性植物都会受到感染，预计症状严重程度在具有相同基因型的植物中是同质的。
可以根据相同样本的算术平均值或症状进展曲线下面积（AUSPC）计算相应样本上不同观察日期的症状严重程度指数，计算公式如下：

AUSPC =Σ[（S 1 + S 1 + 1））×（t i + 1 -t i））/ 2]

其中，S 是在日期t i 处观察到的症状严重性指数。

DAS-ELISA

OD读数后，从所有值中减去阴性对照（PBST）的平均值。计算技术复制的手段。当样品优于0.1时，样品被认为是阳性的，两倍于未接种对照的平均值。表1提供了ELISA数据分析的一个例子。

表1.每个样品两次重复和PBST对照重复四次的ELISA数据分析实例

* OD_cor对应于样品的OD 405nm减去PBST对照的OD 405nm的平均值。
**如果平均值（OD ）优于0.1和两倍于未接种的对照（此处为0.002），则认为样品为阳性。
高度抵抗的控制是负面的，除了阻力分解的情况下，而Azucena和IR64预计是积极的。使用半定量分析可以区分敏感和部分抗性种质，但需要进行初步测试以确定最大化样品间差异的稀释范围。

笔记

RYMV是感染水稻和野生草的病毒病原体，其操作可能受到生物安全问题的限制。
根据你所在国家的法律来操纵病毒
抗性或易感性取决于植物和病毒基因型之间的特定相互作用，抗性或易感对照的选择也可能取决于您的RYMV分离株和实验目标。如果高度耐药的对照在15日龄之前显示出RYMV症状，那么您的接种物可能含有抗性突变基因型（Hébrard et al。2006;Traoré et al。，2010; Pinel-Galzi等人，2017; Pinel-Galzi等人，2016;Hébrard等人，<2018年>），并且将是不适当的用于评估您材料的抗性表型。此外，为了避免错误解释，强烈建议使用与抗性等位基因相关的分子标记来检查每批种子中的抗性等位基因的存在（Thiémélé et al。，2010; Orjuela et al。，2013; Pidon et al。，2017）。
被感染的叶片可用作接种源，可保存在-20°C数月或数年。但是，当接种源是在田间采集的叶子样品或保持在干燥条件下时，推荐在敏感对照或初步DAS-ELISA测试中增殖病毒。
在DAS-ELISA试验过程中，在37°C孵育1或2小时，可以在4°C温育过夜，前提是在必须进行比较的实验之间使用相同的程序。
如果需要，可以通过结合以下步骤来减少DAS-ELISA中的背景反应：（i）将2％聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）加入到1x PBST（样品制备缓冲液）中; （ii）将2％PVP-40和1％脱脂牛奶加入共轭稀释溶液（1×PBST）中。

食谱

磷酸盐接种缓冲液（0.1 M pH 7.2）
准备0.1M KH 2 PO 4：1.36g在100ml MilliQ水中的溶液。
准备0.1M Na 2 HPO 4：1.41g在100ml MilliQ水中的溶液。
将32ml KH 2 PO 4 0.1M与68ml Na 2 HPO 4 0.1M混合，用pH计控制pH值。它应该是pH值为7.2
在4°C储存
用于ELISA测试的缓冲液

磷酸盐缓冲盐水吐温（PBST）浓缩10倍（1升） 79.5克NaCl
1.9克KH 2 PO 4 4克/升 11.36克Na 2 HPO 4无水
1.93克KCl
称量并溶解900毫升MilliQ水中的上述化学物质，pH值应为6.8
加入5毫升吐温20，调节体积至1升。在室温下保存
使用时，用MilliQ水稀释10倍。
涂层缓冲液pH 9.6（500毫升）
0.79克Na 2 CO 3 3 1.425g NaHCO 3 /
称量并溶解450毫升MilliQ水中的上述化学物质，pH应为9.6
用MilliQ水将终体积调整至500 ml
在4°C储存

底物缓冲液（二乙醇胺）
取49毫升二乙醇胺，加入400毫升MilliQ水，拌匀。

用10 N HCl调pH至9.8 用MilliQ水完成高达500毫升
在4°C储存

致谢

该协议是从先前在不同实验室中使用的程序开发的（Fauquet和Thouvenel，1977; Yassi等人，1994;Konaté等人，1997; N'Guessan等人，等人，2001; Albar等人，1998）。这项工作由全球水稻科学伙伴关系（GRiSP）资助，作为新前沿研究计划（MENERGEP项目）。作者感谢Ajayi博士在手稿更正方面的帮助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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