材料和试剂

1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
15ml离心管（Corning，Falcon ，目录号：352196）
吸水纸
175cm 2烧瓶（Greiner Bio One International，CellStar，目录号：660160）。
带有0.4μm多孔聚酯膜和12mm直径的Transwell插件（Corning，Transwell ，目录号：3460）
12孔板（包含在康宁Transwell 包装中;如果需要附加板：康宁，Costar ®，产品目录号：3513）
细胞系HT29（European Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC），目录号：91072201）和HT29-MTX-E12（European Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC），目录号：12040401）或其他待测试其粘液生产
去离子水
70％乙醇
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：31966021）
热灭活的胎牛血清（FCS）
100x青霉素/链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
100x非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11140050）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.0-7.2（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190144）
0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
用于粘蛋白的ELISA试剂盒（CLOUD-CLONE，目录号：SEA705Hu）
注意：在该方案中，ELISA试剂盒SEA705Hu用于测量人粘蛋白2（MUC2）。用于不同物种和粘液蛋白的试剂盒可在Cloud-Clone Corp.获得，例如SEA413Mu用于测量小鼠粘蛋白1（MUC1））。
N-乙酰-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165）
细胞培养基（见食谱）
N-乙酰-L-半胱氨酸工作溶液（见食谱）

设备

无菌钳
洗涤液容器
多道移液器（体积范围：20-200μl）
水浴
加湿的CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM 150i）
生物安全柜
血细胞计数器（品牌，Neubauer改进，目录号：717805）
37℃培养箱（例如，CO 2培养箱，37℃，CO 2关闭）。
用于CO 2孵化器的轨道振荡器（Infors，型号：Celltron）
超声波发生器（Ultrasonic Homogenizer，BioLogics，型号：300VT）
微量离心机（Eppendorf，型号：5418）
Swing桶式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Megafuge TM 16R）
酶标仪（Tecan Trading，型号：Infinite <200>）

程序

请参见图1，了解此协议中描述的工作流程概述

图1.本协议中描述的工作流程示意图概述A.如何在培养物中解冻，扩增和维持HT29和HT29-MTX-E12（E12）细胞的程序在程序A中描述的协议。 B.基于Transwell插入物的模型的生成和维护以及如何启动不同的培养条件（静态与半湿润界面与机械刺激（SWMS））在程序BC中规定。在程序C中，去除粘附的粘液和描述了用于粘附性粘液定量的模型的制备。 D.在随后的数据采集和分析中进行的粘液ELISA的程序在本程序的程序D和“数据分析”部分中进行了解释。

生长和维持HT29和HT29-MTX-E12（E12）细胞
注意：开始之前，将细胞培养基加热至37°C。
1. 通过在37℃水浴中温和搅拌，快速解冻一小瓶含有1×10 6个细胞的冷冻HT29和HT29-MTX-E12（E12）细胞。为了减少污染的可能性，请将管的盖子从水中取出。一旦内容物解冻，立即从水浴中取出小瓶，并用70％乙醇仔细去污。从这一点开始，所有进一步的步骤都应该在严格的无菌条件下进行。
2. 将小瓶内容物转移至含有9ml温热细胞培养基的15ml离心管中，并在室温下以300Xg g离心5分钟，同时进行最大加速/减速设定。弃上清。将细胞重悬于1ml预热培养基中，并将细胞悬浮液转移至含有25ml预热培养基的175cm 2烧瓶中。
  将烧瓶置于37℃的湿润CO 2强制空气培养箱中。
3. 接种24小时后，在显微镜下检查细胞是否附着，如果附着于烧瓶表面，则缓慢吸出培养基以除去死细胞并加入25ml新鲜预热培养基。每2-3天更换一次媒体。
4. 当细胞达到80％融合时，它们可以进行传代。
  在将细胞用于实验之前，细胞需要传代至少3个周期注意：这是使细胞有时间从融化中恢复的必要条件，并且可能因细胞类型而异。使用本协议中使用的HT29和E12细胞直到第20代。
5. 为了传代，移出培养基并用10ml PBS洗涤单层。加入5ml预热（37℃）胰蛋白酶-EDTA溶液并在37℃下孵育3-10分钟。在显微镜下定期检查细胞脱落。当细胞开始分离时，加入5 ml温培养基以灭活胰蛋白酶并彻底吸移几次以获得均匀的细胞悬液（产生粘液的细胞倾向于形成细胞团块）。
  注意：胰蛋白酶-EDTA溶液的孵育时间和随后细胞的分离随着细胞类型的不同而不同，细胞的分离应定期在显微镜下控制以避免过长的孵育时间。
  
  通过用手轻轻敲打细胞培养瓶，可以加快分离过程。
6. 将细胞悬浮液转移到15ml离心管中并在室温下300×g离心5分钟。弃去上清液并重悬于5ml预热培养基中的细胞。使用血细胞计数器计数细胞并将7×10 5个细胞转移到具有25ml新鲜预热培养基的新的175cm 2烧瓶中。剩下的细胞可以用于后续的实验。
细胞培养模型的设置和培养
1. 打开Transwell ®插件的包装并将它们放入12孔板的空腔中。随后，如步骤A5和A6中所述收获并计数HT29和E12细胞。将获得的细胞悬浮液的细胞浓度调节至每毫升2.73×10 5个细胞的工作浓度。
2. 为了建立模型，将275μl含有7.5×10 4 HT29或E12细胞的细胞悬液加入到膜的顶侧，并将1ml培养基加入到基底隔室中。
  培养细胞培养箱中的培养板过夜
3. 第二天，改变培养基并启动具有机械刺激（SWMS）的培养条件半湿界面以增强粘液产生。
  1. 为了产生静态培养条件，如步骤B4所述，用275μl和顶部隔室用1ml预热（37℃）培养基代替顶部隔室中的培养基。
    在细胞培养培养箱中培养细胞15天，并在培养基更换期间保持培养基体积。
  2. 为了产生具有机械刺激（SWMS）的培养条件半湿界面，如步骤B4所述，用75μl和顶部隔室中的850μl预热（37℃）培养基代替顶部隔室中的培养基。在细胞培养箱中以65rpm的速度将细胞孵育在轨道摇床上15天，并在培养基更换期间保持培养基体积。
4. 每隔1-2天应进行一次培养基交换，因为分泌的粘液会使培养基酸化（培养基变黄）。要更换培养基，请首先吸入基底隔室中的培养基。然后，使用无菌镊子将Transwell™插入物取出并非常小心地吸出顶端介质，而不会干扰细胞或贴壁粘液层。随后，非常小心地将275μl或75μl新鲜的预热培养基填充到顶端隔室中，并将插入物放回其腔体中。最后，将1 ml或850μl填充到下部隔室中，并将其保持一定角度以避免隔膜下方出现气泡。内部和外部隔室中的介质应具有相同的高度。
通过ELISA制备粘液定量模型
1. 15天后，模型已准备就绪，可用于实验。如果需要定量分泌粘液粘液，则应如步骤C2所述处理模型子集，否则继续步骤C3。
  备注：
  1. 对于实验而言，可感知的想法可以是在存在和不存在粘附性粘液层的情况下测试细菌的定殖效力，或测试存在和不存在粘附性粘液层时颗粒通过细胞层的扩散。
  2. 如果使用其他细胞类型，可通过在不同时间点进行粘液ELISA来确定最大粘液产生的最佳培养时间。此外，可以制备组织切片并用PAS /阿尔新蓝染色以染色粘液并获得细胞层中粘液定位的定性概述。
2. 粘液溶解剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）用于化学去除粘附的粘液。 NAC具有低毒性，并通过粘蛋白中二硫键的不可逆还原降低了粘液的粘度。
  1. 为此，请按照步骤B4所述移除介质。
  2. 将500μl预热（37℃）NAC工作溶液加入到顶室中，并将1.5ml预热（37℃）的培养基加入基底室以平衡两个室中的中等水平。随后，将准备好的模型置于轨道振动器上1小时，然后在细胞培养箱中转速为65转/分钟。
  3. 用PBS清洗两个隔室一次并继续步骤C3。
3. 为了分离细胞，如步骤B4中所述小心地吸出培养基并小心地用PBS将两个隔室洗涤一次，向顶端加入500μl，并向基底隔室加入1.5ml。
4. 如步骤B4所述去除PBS，并向每个模型添加预热（37℃）胰蛋白酶-EDTA溶液（500μl顶端，1.5ml基底）。在细胞培养箱中37°C孵育10-15分钟。
5. 通过彻底吸取细胞数次以分离细胞以获得均匀的细胞悬液并将溶液转移至含有500μl培养基的1.5ml管中。随后，计数血细胞计数器中的细胞。
  注意：当细胞开始分离时，流体变得浑浊，膜上可见小的“孔”。
6. 应通过ELISA分析相同数量的细胞。因此，将每种方法的4×10 6个细胞转移到新的1.5ml管中，并在4℃下以2000×g离心5分钟。在500μl冰冷的PBS中重悬沉淀。随后，使细胞悬液在冰上以20kHz超声处理4次10秒（避免起泡）。
  注意：要分析的细胞数量可以变化，并且应该基于细胞的粘液产生预先粗略估计，以在ELISA中实现最佳结果。
7. 在4℃下以1500 xg g离心10分钟以除去细胞碎片。 ELISA需要上清液。使用前将样品保存在冰上。
ELISA和数据采集
1. 在以下步骤中，根据制造商的说明进行测定。重新构建试剂盒中包含的标准，并用7分制备稀释系列。
  根据制造商的说明重新构建套件中包含的所有其他组件
2. 对每个标准进行重复读数的实验，空白（标准稀释剂，包括在试剂盒中）和样品。将预先包被的ELISA板加入100μl标准品，空白和样品，并在37℃孵育2小时。除去每口井的液体，不要清洗。加入一抗并在37℃下孵育1小时。用洗涤溶液将每个孔清洗三次，并在37°C下与HRP缀合的二抗孵育30分钟。每次再次洗涤5次，随后在37℃在黑暗中与3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液一起温育15-25分钟。加入硫酸终止反应，并用微孔板读数仪立即在450 nm处测量吸收。
  注意：添加TMB底物会使液体变蓝。 TMB底物的孵育时间很关键，可能会有所不同。因此强烈建议定期检查反应过程。最高标准应该观察到最强的蓝色着色。在这个协议中，大约20分钟就足够了。加入Stop溶液后液体会变黄。通过敲击板的侧面将液体混合至均匀。在某些情况下，测量前需要稀释以获得最佳测量结果。

数据分析

典型的测量结果如图2A所示。首先，平均每个标准品，空白和样品的重复读数，并减去平均空白光密度。接下来，绘制标准曲线，绘制线性y轴上每个标准的平均光密度（OD）和线性x轴上的粘液浓度。创建一个线性回归线，并使用回归线公式计算样本的平均测量OD值的粘液浓度（图2B和2C）。如果样品被稀释，从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释倍数。
为了计算分泌粘液的量，必须从未处理的样品的粘液浓度中减去NAC处理的样品的粘液浓度。差异代表分泌粘液的量（图2C）。

图2.在不同培养条件下HT29和HT29-MTX-E12（E12）细胞中使用MUC2ELISA进行的测量的示例性数据分析A.显示在450nm下使用微孔板读数器的典型吸收测量值平均重复读取空白，标准和样本后。 B.与TMB底物的孵育时间为20分钟。使用标准的OD450测量值，可以在减去平均空白值后创建标准曲线。通过插入线性回归线，可以使用回归线方程计算样品的粘液浓度。 C.在减去NAC处理的样品之后和之后显示样品的计算的粘液浓度，可以确定分泌的粘液的量。

食谱

细胞培养基（500毫升）
440毫升DMEM，高糖，GlutaMAX
50毫升FCS
5毫升青霉素/链霉素
5毫升非必需氨基酸
N-乙酰-L-半胱氨酸工作溶液（60 mM）
10毫升DMEM，高糖，GlutaMAX
97.9毫克N-乙酰-L-半胱氨酸

致谢

该协议改编自Reuter 等人（2018）。这项工作得到了Ardeypharm GmbH的部分支持。作者没有任何潜在的利益冲突声明。

参考

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