材料和试剂

10μl移液枪头（Thermo Fisher Scientific，目录号：3510）
200μl移液枪头（Wolf Laboratories，目录号：2100.YN）
1,000μl移液枪头（赛默飞世尔科技，产品目录号：3580）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
PVDF膜
X光胶片（Advansta，目录号：L-07014-100）
5日龄苗木
MS盐（Caisson，目录号：MSP01-50LT）
UltraPure TM蔗糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15503022）
BTH（Acibenzolar-S-甲基）（Sigma-Aldrich，目录号：32820）＆nbsp;
甲醇（VWR，BDH，目录号：10158）
液氮＆nbsp;
PIC（蛋白酶抑制剂混合物）（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
Tris底座（沉箱，目录号：T041-1KG）
NaCl（Alfa Aesar，USB，目录号：J21618）
EDTA（Alfa Aesar，USB，目录号：J15701）
SDS（十二烷基硫酸钠）（Alfa Aesar，USB，目录号：J75819）
Triton X-100（GE Healthcare，Amerrsham，目录号：17-1315-01）
甘油超纯（Alfa Aesar，USB，目录号：J16374）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
尿素（阿法埃萨，USB，目录号：J75826）
40％丙烯酰胺/双溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0148）
TEMED（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0801）
APS（过硫酸铵）（USB，目录号：US76322）
非脂肪奶粉
ATG8抗体（Agrisera，目录号：AS14 2769）
cFBPase（Agrisera，目录号：AS04 043）
二抗（抗兔IgG过氧化物酶缀合物，Sigma-Aldrich，目录号：A6154）＆nbsp;
Precision Plus Protein TM双色标准品（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0374）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（VWR，目录号：144-55-8）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（USB，目录号：21602）＆nbsp;
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）（USB，目录号：20233）
磷酸氢二钠二水合物（Na 2 HPO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：04272）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31248）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：63158）
MS液体培养基（见食谱）
10毫米BTH股票（见食谱）
25倍的PIC（见食谱）
10％（v / v）Triton X-100（见食谱）
1M Tris-HCl原液（pH 6.8或pH 7.4）（见食谱）
0.5 M EDTA（pH 8.0）（见食谱）
5倍提取缓冲液（见食谱）
含有1x PIC和1％（v / v）Triton X-100的1x提取缓冲液（见食谱）
5倍样品加载染料（见食谱）
30％APS（见食谱）
3倍分离缓冲液（见食谱）
5倍堆叠缓冲区（请参阅食谱）
含有6M尿素的15％SDS-PAGE凝胶（参见食谱）
1. 15％尿素分离胶
2. 5％堆叠凝胶
运行缓冲区（请参阅食谱）
传输缓冲区（请参阅食谱）
PBS（见食谱）＆nbsp;
PBS-T（见食谱）

设备

Eppendorf Research 加移液管0.5-10μl（Eppendorf，产品目录号：3120000020）
Eppendorf Research 加移液管10-100μl（Eppendorf，产品目录号：3120000046）
Eppendorf研究加移液管100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3120000062）
灰浆和杵
离心机（Eppendorf，型号：5430）
X光胶片盒（Amersham Biosciences Hypercassette TM TM）
超速离心管（7 x 20 mm）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM MAX-XP）
Western Blotting设备（Bio-Rad）
开发者机器（Fujifilm FPM100A）

程序

在含有或不含100μMBTH的MS液体培养基（10mM储液在甲醇中）中培养0.2g 5天的拟南芥幼苗8小时（见注1和注2）。
用液氮将砂浆中的幼苗冻结并彻底研磨植物。
将含有不含去污剂的PIC的2x提取缓冲液加入研钵中。
在冰上缓慢解冻后，将液体转移到1.5ml管中，并在1,000℃×g下离心5分钟，4℃。
将上清液转移到超速离心管（7×20mm）中并在100,000×gg下离心4分钟45分钟。
将上清液（细胞溶解部分，CS）转移到带有标记的新Eppendorf管中并保持在冰上。
用含有1x PIC的1x提取缓冲液轻轻洗涤托盘（细胞膜部分，CM）2-3次。
注意：在此步骤中，轻轻地添加1x提取缓冲液，不要接触托盘表面，不需要离心机和重新悬浮。此步骤的主要目的是清洗CM表面上剩余的CS液体。
使用含有1x PIC和1％（v / v）Triton X-100的1x提取缓冲液重新悬浮托盘以溶解膜。
将5倍样品加载染料添加到CS和CM样品中。
将样品在100°C煮10分钟。
用6M尿素制备15％SDS-PAGE凝胶。
注意：只能在分离胶中加入尿素。
加载CM样品并用1x运行缓冲液在90 V下运行3 h。
在蓝色条带到达凝胶底部后，再以90V运行30分钟（见注3和4）。
使用1x转移缓冲液将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，电压为55 V.
印迹后，将印迹膜浸入含有5％奶粉的1x PBS中1小时。用PBS-T清洗3次。
用ATG8特异性一抗（PBS-T中4μg/μl）孵育1小时。用PBST洗涤3次。
与二抗（1：5,000在PBS-T中）孵育1小时。用PBS-T清洗3次。
将蛋白质印迹检测试剂添加到膜上，并将其暴露于X射线胶片或使用成像设备。（图1）

数据分析

如图1所示，在野生型（WT）背景中，来自CM样品的ATG8-PE在BTH诱导后增加，大小约为12-15kDa，表明自噬是由自噬体形成诱导的。然而，在自噬诱导后ATG5缺陷突变体中未检测到ATG8-PE，这意味着自噬体形成受到抑制。不同的是，在atg9突变体中检测到更高水平的ATG8-PE，表明自噬体形成可能在某个阶段中断。 ATG8抗体检测中可能存在非特异性条带。此外，应该指出的是，在拟南芥属基因组中存在多种ATG8同种型，其具有不同的SDS-PAGE迁移率，导致与ATG8-PE加合物具有相似大小的交叉反应物种的检测，以及使得结果相互矛盾（Chung等人，2010年）。因此，分别将WT和 atg5 样品作为阳性和阴性对照以鉴定ATG8-PE的正确大小是非常关键的，因为atg5突变体缺乏ATG8- PE但积累了大量的非脂化ATG8。我们在共焦和电子显微镜下的进一步检查发现ATG8标记的异常小管在atg9突变体中积累，因此证明ATG9是自噬体进展所必需的（Zhuang等， 2017年）。因此，ATG8脂化测定应结合其他方法如显微镜分析来进一步评估自噬活性。

图1.在拟南芥中野生型和 atg 突变体中的ATG8脂化检测 5天龄的野生型将atg5和atg9幼苗分别在含有或不含BTH处理（+ B和-B）的MS液体培养基中温育8小时。对粗提取物进行超速离心以收集细胞膜部分（CM），随后用植物ATG8抗体进行免疫印迹。 cFBPase代表用免疫印迹cFBPase抗体的加样对照。

笔记

确保幼苗在自噬诱导之前没有任何压力的情况下保持良好状态是至关重要的，否则应激幼苗会诱导自噬活性，这可能会使结果模糊不清。＆nbsp;
推荐在ATG8脂化中包含已知的 atg 突变体（ eg ， atg5 或 atg7 ）作为阴性对照在脂化测定中。
当运行SDS-PAGE时，尿素凝胶会产生大量热量，并且应保持在低电压下，以便两种形式的ATG8可以很好地分离。
ATG8-PE仅出现在膜部分上，因此CM样品用于检测ATG8-PE加合物。具有非脂质化ATG8的CS级分可以包含在蛋白质印迹中作为区分非脂质化ATG8和脂质化ATG8的对照。

食谱

MS液体培养基（350ml）

组件
体积/数量

MS盐

1.515克

蔗糖
3.5克

ddH <2>
高达350毫升

调整pH值至5.7（含KOH）
10毫米BTH股票（10毫升）＆nbsp;

组件
体积/数量

BTH
0.021克

甲醇
10毫升
25倍PIC（2毫升）

组件
体积/数量

PIC
一个平板电脑

ddH <2>
2毫升
10％（v / v）Triton X-100（100ml）

组件
体积/数量

Triton X-100
10毫升

ddH <2>
90毫升
1 M Tris-HCl储备液（pH 6.8或pH 7.4）（100 ml）＆nbsp;

组件
体积/数量

Tris基地
12.114克

ddH <2>
到100毫升

用浓水将pH调节至6.8或7.4。 HCl
0.5M EDTA（pH8.0）（100ml）＆nbsp;

组件
体积/数量

EDTA 16.81克

ddH <2>
80毫升

用NaOH调节pH至8.0（〜10g氢氧化钠丸粒）并用ddH 2 O加入到100ml中。

5倍提取缓冲液（10ml）

组件	体积/数量
250mM Tris-HCl（pH7.4）	2.5毫升1M Tris-HCl（pH 7.4）
750 mM NaCl	0.438克
5mM EDTA	0.1毫升的0.5 M股票
ddH <2>	到10毫升

含1x PIC和1％（v / v）Triton X-100（10ml）的1x提取缓冲液。

组件	体积/数量
1x提取缓冲液	2.5毫升的5倍提取缓冲液
1x PIC	0.40毫升的25x PIC
1％（v / v）Triton X-100	1ml 10％（v / v）Triton X-100
ddH <2>	到10毫升

样品加载染料（5x，50毫升）

组件	体积/数量
1M Tris-HCl（pH6.8）	12.5毫升
SDS	5克
甘油	25毫升
溴酚蓝	0.25克
β-巯基乙醇	6.25毫升
ddH <2>	到50毫升

30％APS（10毫升）＆nbsp;

组件
体积/数量

APS 3克

双蒸<子> 2 0
10毫升
3倍分离缓冲液（1 L）

组件
体积/数量

Tris碱 136.2克

SDS 3克

双蒸<子> 2 0
最多1升

用浓水调节pH值至8.8。 HCl（约10毫升）
5倍堆积缓冲液（500毫升）

组件
体积/数量

Tris碱 37.85克

SDS 2.5克

双蒸<子> 2 0
高达500毫升

浓缩调节pH至6.8。 HCl（约20毫升）

含6M尿素的15％SDS-PAGE凝胶＆nbsp;

15％尿素分离胶（10毫升）

组件	体积/数量
尿素	3.6036克
丙烯酸酯（40％）	3.75毫升
3倍分离缓冲液	3.33毫升
APS（30％）	20微升
TEMED	5微升
双蒸<子> 2 0	多达10毫升

5％堆叠凝胶（5毫升）

组件	体积/数量
丙烯 - 二（40％）	0.625毫升
5倍堆栈缓冲区	1毫升
APS（30％）	20微升
TEMED	5微升
双蒸<子> 2 0	多达5毫升

运行缓冲区（10x，1L）

组件
体积/数量

Tris基地
30.3克

甘氨酸
144克

SDS 10克

ddH <2>
最多1升
传输缓冲区（10x，1L）

组件
体积/数量

NaHCO 3
8.4克

Na 2 CO 3 3/2 3.2克

ddH <2>
最多1升
PBS（10x，2L）

组件
体积/数量

NaCl
80克

NaH 2 PO 4 4 H 2 O
2.3克

Na 2 HPO 4·2H 2 O O 2/2 13.9克

氯化钾 2克

ddH <2>
最多2升

用10N NaOH调节pH值至7.4
PBS-T（1L）

组件
体积/数量

1x PBS 1 L

Tween-20
0.5毫升

致谢

本议定书改编自2017年的Zhuang e t 。。Fundings来自香港研究资助局（G-CUHK402 / 15，G-CUHK403 / 17，CUHK14130716，CUHK14102417，C4011-14R，C4012-16E，C4002-17G和AoE / M-05/12）和国家自然科学基金中国基金会（31470294和31670179）支持这项工作。作者声明不存在利益冲突。

参考
1. Chung，T.，Phillips，A.R。和Vierstra，R.D。（2010）。 ATG8脂化和ATG8介导的自噬在 Arabidops i < 要求ATG12表示由差分控制的 ATG12 A 和 A T > 1 2 B 位点。 l a J 62（3）：483-493。
2. Li，F.，Chung，T。和Vierstra，R.D。（2014）。 AUTOPHAGY-RELATED11在自噬和衰老诱导的线粒体自噬中起关键作用 rabidop s s 。 Plant Cell 26（2）：788-807。
3. Liu，Y.和Bassham，D.C。（2012）。自噬：植物细胞自我进食的途径 Annu Rev Plant Biol 63：215-237。
4. Mizushima，N.，Yoshimori，T.和Levine，B。（2010）。哺乳动物自噬研究方法 e l l 140（3）：313-326。
5. Mizushima，N。和Yoshimori，T。（2007）。如何解读LC3免疫印迹自体吞噬 3（6））：542-545。
6. Ohsumi，Y.（2001）。泛素和蛋白酶体：自噬的分子解剖：两个泛素样系统 Nat Rev Mol Cell Bio l 2（3）：211-216。
7. Suttangkakul，A.，Li，F.，Chung，T。和Vierstra，R.D。（2011）。 ATG1 / ATG13蛋白激酶复合物既是一种调节剂，也是自噬循环的目标拟南芥。植物 l 23（10）：3761-3779。
8. Zhuang，X.，Chung，K. P.，Cui，Y.，Lin，W.，Gao，C.，Kang，B. H. and Jiang，L.（2017）。 ATG9调控 Arabidopsi 的内质网的自噬体进程。 Proc Natl Acad Sci USA 114（3）：E426-E435。