材料和试剂

移液器吸头：
101-1,000μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1122-1832）
0.1-10μl（USA Scientific，TipOne，目录号：1120-3812）
手套（VWR，目录号：82026-424）
Nalgene杜瓦（用于液氮）（Sigma-Aldrich，目录号：F9401）
三元聚丙烯烧杯（用于冷却液氮中的异戊烷）（VWR，目录号：89011-786）
制造商：MEDEGEN MEDICAL PRODUCTS，产品目录号：PB5935-400。
用于冷冻切片的MX35 Ultra Low-Profile刀片（Thermo Fisher Scientific，目录号：3053835）
Superfrost Plus幻灯片（Fisher Scientific，产品目录号：12-550-15）
Shandon Single Cytoslides（Thermo Fisher Scientific，目录号：5991056）
Shandon Single Cytofunnel（Thermo Fisher Scientific，目录号：5991040）
ImmEdge PAP笔（Vector Laboratories，目录号：H-4000）
1.5 ml微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5599）
15毫升锥形管（VWR，目录号：89039-666）
24×50毫米，1号玻璃罩（VWR，目录号：48393-081）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34120）
软木塞制作肌肉坐骑（Fisher Scientific，目录号：07-782J）
聚四氟乙烯（聚四氟乙烯）涂层不锈钢刮刀（Fisher Scientific，目录号：21-401-50A）
制造商：Saint-Gobain Performance Plastics，产品目录号：D1069292。
＃10弯曲刀片一次性手术刀（斯克拉手术器械，目录号：06-3310）
Dumont＃7弯钳（Fine Science Tools，目录号：11270-20）
Cryo Tongs（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：4000388）
黄蓍胶，粉末（Sigma-Aldrich，目录号：G1128-500G）
Fisher O.C.T化合物（Fisher Scientific，目录号：23-730-571）
异戊烷（2-甲基丁烷）（Merck，目录号：MX0760-1）
液氮（Scott Gross，目录号：SG＃347）
干冰（斯科特格罗斯，没有产品目录号）
冰冷的丙酮，储存在-20°C（Fisher Scientific，目录号：A18-4）
链霉抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒（Vector Laboratories，目录号：SP-2002）
2.5％正常马血清（NHS）（Vector Laboratories，目录号：S-2012）
50％1xPBS（参见21和配方）/ 50％甘油封闭介质（甘油-VWR，目录号：BDH1172-1LP）或Vectashield（Vector Laboratories，目录号：H-1000）
用于IHC的抗体，用2.5％正常马血清或PBS制备的稀释液（表2）
ImmPRESS-AP抗小鼠IgG（碱性磷酸酶）聚合物检测试剂盒（Vector Laboratories，目录号：MP-5402）
ImmPACT载体红色碱性磷酸酶（AP）底物（Vector Laboratories，目录号：SK-5105）
多通道流式细胞术的抗体（表3）

LIVE / DEAD固定蓝色死细胞染色试剂盒，用于紫外激发（赛默飞世尔科技，产品目录号：L34961）（表3）
UltraComp eBeads补偿珠（赛默飞世尔科技，产品目录编号：01-2222-41）
聚氨酯冰桶（Fisher Scientific，目录号：02-591-45）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1. 去离子（DI）水
2. 氯化钠（NaCl）（VWR，目录号：97061-266）
3. 磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（VWR，目录号：200007-704）
  制造商：Acros Organic，产品目录号：206515000。
4. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Aldon，目录号：PP0730-500GR）
5. 氢氧化钠10 N（NaOH）（VWR，目录号：BDH7247-1）
6. 盐酸6N（HCl）（VWR，目录号：97064-758）
30％过氧化氢，ACS，稳定（VWR，目录号：BDH7690-1）（见食谱）
DAPI染色细胞核（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes TM，目录号：D1306）（见食谱）
兔多克隆抗层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L9393）。在2.5％NHS中以1：100的稀释度使用。

设备

具有自动舞台的落射荧光显微镜（ZEISS，型号：Axio Imager M1）
Cryostat（Thermo Fisher Scientific，型号：HM525 NX）
P1000移液器（Gilson，目录号：F123602）
P10 pipetman（Gilson，目录号：F144802）
P2 pipetman（Gilson，目录号：F144801）
玻璃Coplin罐（VWR，目录号：470175-194）
制造商：VARIETY GLASS，目录号：674。
加湿玻片室（10个带黑色盖子的玻片染色盘）（Electron Microscopy Sciences，目录号：71396-B）
变速2D摇摆器，14 x 12工作表面（USA Scientific，目录号：2527-2000）
4°C冰箱（Fisher Scientific，型号：Isotemp Value Lab，目录号：17LREEFSA）
-80°C冰箱（赛默飞世尔科技，型号：Revco <®> Elite Plus）
II类A / B3生物安全柜（NuAire）
配备355 nm，405 nm和488 nm激光器（BD Biosciences）的LSR II流式细胞仪
Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge（Thermo Fisher Scientific，目录号：A78300003）

软件

图像捕捉软件（蔡司，禅蓝色）
带有事件计数工具的图像处理软件（Zeiss，Zen Blue或Zen Lite）
Prism7或同等的图形软件（GraphPad）
FlowJo v10（FlowJo）

程序

多道流式细胞术验证免疫组织化学（IHC）巨噬细胞标记物
1. 约3克人体骨骼肌肉组织从正在用于ACL重建手术的患者ha绳肌肌腱中清除（由训练有素的医务人员在手术室中进行）。
2. 将骨骼肌组织放入冰桶中，放在冰上运回实验室，然后放入紫外线消毒的生物安全柜内，并在生物安全柜内执行所有可能的剩余步骤。
3. 根据需要将骨骼肌标本分成多块（每块1-2g），以便获得最佳的组织消化。
4. 根据此处提及的已建立的方案分离骨骼肌单核细胞（Liu等人，2015）。
5. 获得单细胞悬浮液后，在4℃以500gxg（rcf）（相对离心力或重力）离心5分钟，并轻轻制动以沉淀细胞。
6. 通过用1ml无菌（高压灭菌）的1x PBS再悬浮来清洗细胞沉淀，如果需要，在该步骤中，可以将来自多个肌肉块的细胞悬浮液重新组合回到一个样品中。
7. 重复步骤A5以沉淀细胞并重悬于500μl荧光团缀合的抗体混合物中（表3）。
8. 混匀，上下移液6-8次，在4°C黑暗中孵育1小时。
9. 在4℃以500gxg（rcf）离心5分钟，轻轻制动以沉淀细胞，然后重悬于无菌1x PBS中以洗涤。
10. 重复步骤A9第二次洗涤，然后将细胞沉淀物重悬于1ml无菌1x PBS中用于FACS。
11. 储存在冰桶中，冰上，直到荧光激活细胞分选（FACS）。
  1. 用每个单独的抗体孵育1滴UltraComp eBeads补偿珠，并按照制造商的方案设置每个荧光团结合抗体的单通道补偿参数。
  2. 应始终运行未染色的细胞悬液样本以确定阴性细胞群的位置（Liu等人，2015年）。
  3. 通过LIVE / DEAD固定蓝色染色确定死细胞，并仅通过对活细胞进行门控来排除它们。
  4. 使用前向散射高度（y轴）和前向散射面积（x轴）设置一个不包括双峰的门（Liu等人，2015年）。
  5. 将适当荧光团中的同种型对照抗体用作对照以确保抗体染色特异性（表3）。
12. FACS将CD11b + / CD14 +细胞分选用于免疫细胞化学（ICC）并收集到1x PBS中。
13. 在分选之后，通过在4℃下以500μgxg离心5分钟沉淀细胞，并在600μl的1x PBS中重悬。
14. 将200μl细胞悬液装入Shandon Single Cytofunnel中，并用Shandon Cytospin 4以1,000转/分钟（RPM）离心3分钟，以将细胞置于Shandon Single Cytoslides上。
15. 使用PAP笔跟踪印在幻灯片上的圆圈，指示样品位于何处，并允许载玻片在室温（RT）下在台上风干30分钟。
16. 按照以下CD11b / CD206双重IHC方案的步骤C8-C22，用1：100稀释度的抗CD68（步骤C20c）替换抗CD11b的一抗（表2）。
17. 在与主要抗CD68抗体孵育过夜（ON）并洗涤后，在室温下用ImmPRESS-AP，抗小鼠IgG（碱性磷酸酶）聚合物检测试剂盒孵育细胞1小时，摇动（表2）。
18. 弃去ImmPRESS-AP试剂并通过将1×PBS移液至PAP笔圈中洗涤细胞，然后在室温下摇动5分钟。重复洗3次，共洗涤4次。
19. 根据制造商的方案（表2），使用ImmPACT Vector Red试剂盒加入碱性磷酸酶底物以显现CD68 +染色。
  1. 使用标准光学显微镜可以监测染色强度以确定最佳染色时间量;发现10-20分钟就足够了。
  2. 染色将是发色（显示红色）和荧光（使用TRITC滤光片立方体可见）。
20. 重复步骤A18（上述）以使用50％1x PBS / 50％甘油洗涤和盖玻片。
21. 在4°C的黑暗环境下拍摄或存放长达一个月（图2）。
  
  图2.验证CD11b作为人骨骼肌中的泛巨噬细胞表面标记物A.代表性图像显示具有DAPI染色细胞核的泛，胞内巨噬细胞标记物CD68（绿色）的IHC的代表性图像（蓝色）在人的股外侧肌肉。比例尺= 50μm。 B.CD11b +和CD68 +巨噬细胞数量的相关性，通过IHC鉴定来自股外侧肌的连续切片，n = 44个分析的肌肉样品。由Pearson相关性确定的P 值，r = Pearson相关系数。 C.通过荧光激活细胞分选（FACS）分离CD14 + / CD11b +单核细胞（显示于图1，图A），并对CD68进行染色。阳性染色是显色的（用透射光，明场，BF成像时为红色）和荧光（假彩色粉红，FL）。左图：CD68 BF;阳性染色是红色的。右：CD68 FL，阳性染色是粉红色的。细胞核用DAPI（蓝色）标记。 d-E。显示来自图C的CD68-事件（D）和CD68 +细胞（E）的高放大图像.CD68-事件很小（<10μm）并且看起来不是单核细胞/巨噬细胞。 CD68-结构似乎用DAPI染色，表明这可能是细胞碎片（没有细胞质的细胞核）。比例尺= 10微米。
从Bergstrom针头人骨骼肌活组织检查中制备IHC坐骨神经（Tarnopolsky等人，2011，Shanely等人，2014）
注意：此方法对于准备人骨骼肌IHC坐骑是可选的。
1. 将黄蓍胶胶粉和O.C.T化合物与Teflon涂覆的刮刀以1份黄蓍胶胶粉与1.5份O.C.T的比例混合以制成厚糊（固定介质）。
2. 将安装介质应用于软木塞并模制成圆环形状，在放置肌肉标本的中心留下一个孔（图3A）。
3. 骨骼肌活检后，从Bergstrom针头取出组织，并快速识别无脂肪和结缔组织的骨骼肌块。
4. 轻轻地分开单个碎片，选择最大的完整碎片用于免疫组织化学（〜0.5-0.75厘米长，50-100毫克总组织）。
5. 用手术刀修剪任何脂肪，结缔组织或附件骨骼肌肉碎片以清洁样本。
6. 将IHC的每个骨骼肌肉块纵向并排放置，使一端的边缘对齐（这将成为IHC底座的顶部）并用＃10弯曲刀片手术刀修整另一端以对齐（IHC底座的底部）（图3B）。
7. 使用细尖镊子和特氟龙刮刀，将骨骼肌肉块轻轻滚动成实心圆柱形（肌肉圆柱体）。
8. 将肌肉圆柱滚动到刮刀尖端，使底部（修剪的边缘）与刮刀尖端对齐。
9. 将肌肉圆柱/刮刀向上放置，使骨骼肌纤维现在垂直于工作台运行，未修剪的对齐边缘（顶部）朝上。
10. 轻轻地将肌肉圆筒放入安装介质面包圈的中心，靠着面包圈的一侧，并用镊子将压力棒从压舌板上推下。取出抹刀。肌肉圆柱现在垂直于底部的软木塞表面，修剪软木塞的端部和骨骼肌纤维的长轴伸出（图3C）。
11. 使用刮刀，将安装介质加工成完全封闭骨骼肌标本，闭合间隙并在肌肉圆柱体和安装介质之间留下空气袋（这可以保护肌肉标本免受冻害）。
12. 雕刻安装介质的顶部，使其与骨骼肌标本的顶部齐平。
13. 放入液氮冷却的异戊烷中快速冷冻IHC固定2分钟。
  1. 异戊烷应该是泥泞的稠度，刚刚开始形成。
  2. 底座的软木侧应朝上，骨骼肌样品朝下，完全浸没在冷却的异戊烷中。
14. 一旦冷冻，使用钳子从冷却的异戊烷中取出IHC底座，置于干冰上静置5分钟。
15. 最终的IHC支架现在可以储存在-80°C，直到您准备切片（图3D-3E）。
图3.从人骨骼肌制备IHC坐标A.代表性的图像显示了由黄蓍胶粉末和O.C.T.的混合物制成的甜甜圈。（安装介质），在程序B步骤2下描述。B.代表性的图像和插图，描绘了要安装切片的肌肉块的纵向方向。 C.代表性的图像显示肌肉圆柱体放置在由安装介质制成的圆环中。黄色箭头用来说明肌肉的位置，使其抵靠甜甜圈的一面/墙壁。 D.完成IHC肌肉坐标的代表性图像（就在冻结之前）;侧视图（左）和顶视图（右）。
骨骼肌切片和CD11b / CD206双IHC方案
1. 将IHC安装架从-80°C冷冻箱中取出，并运送到干冰上的聚苯乙烯泡沫塑料冷却器中的低温恒温器中。将低温恒温器中的室温设置为-25°C，并将IHC底座放入低温恒温室中。
2. 通过用O.C.T化合物覆盖卡盘顶部，使用镊子将软木塞放入O.C.T，并允许O.C.T通过冷冻硬化，将IHC安装座固定到卡盘上。
3. 在切片之前，让IHC安装座适应室的温度1小时。可能需要为每个样品调整反应室温度，以获得横截面上纤维数量最多的扁平部分。
4. 截面冻结肌肉坐标与8°和10°之间的低温恒温器载物台角度。
  1. 舞台角度可能还需要针对某些样本进行调整;然而，这是不常见的，并且不建议在此范围之外的舞台角度。
  2. 样品应进行调整，以便在切片时，安装架的顶部与刀片垂直。为了获得横截面光纤，可能需要对卡盘/安装座的角度进行小的调整。一旦进行调整，切割的质量部分应至少包含100根肌纤维和不超过20％的纵向纤维。
5. 使用防卷板保持切片不卷曲，切下7微米的冷冻切片并取出带电的Superfrost Plus切片。
6. 在室温下让切片在室温下干燥，然后用ImmEdge PAP笔在圆形样本上染色。
7. 允许PAP笔干燥20-30分钟。
8. 通过将载玻片浸没在含有冰冷丙酮的Coplin罐中，将切片在-20℃固定3分钟。丙酮应储存在-20°C以保持温度。
9. 迅速将边缘滑到纸巾上以排出多余的丙酮，并在室温下转移到装有1x PBS的Coplin罐中。
10. 在1x PBS中摇动幻灯片5分钟;重复洗涤两次，共三次洗涤。
11. 从Coplin瓶中取出载玻片，轻轻轻弹以除去多余的1x PBS，用纸巾擦拭载玻片的背面，并将其置于加湿的载玻片室中，容器中含有大约1.5cm的水。
12. 通过在切片上吸取3％过氧化氢来阻断内源性过氧化物酶，并允许孵育，在RT下摇动8分钟。
13. 轻轻地将过氧化氢倒入纸巾丢弃，用1x PBS代替，并在室温下摇动5分钟。
14. 重复步骤C13两次，总共进行三次洗涤。
15. 将多余的1x PBS倒在纸巾上，轻轻滑动，用纸巾擦拭背部并放回玻片室。
16. 按照制造商的说明使用试剂盒进行抗生蛋白链菌素/生物素阻断，在加湿玻片室中进行所有培养：
  1. 用链霉亲和素封闭液孵育切片15分钟
  2. 简要清洗：2次，1次PBS 2分钟。
  3. 在RT下用生物素阻断溶液孵育切片15分钟。
17. 去除生物素阻断溶液并用1x PBS代替并在室温摇动5分钟。
  使用1x PBS重复洗涤3次。
18. 将1x PBS倒在纸巾上，轻轻滑动以除去多余的1x PBS，用纸巾擦拭玻片后部并返回玻片室。
19. 加入足够量的2.5％正常马血清（NHS）以完全覆盖切片并在4℃下摇动过夜。
20. 取出2.5％的NHS，用kimwipe轻轻地擦拭PAP笔以重新建立疏水屏障，添加CD11b的第一抗体，在2.5％NHS中以1：100稀释，并在4℃下过夜返回摇杆。
  1. 为确保初级抗体对CD11b的特异性，还应通过将纯化的小鼠IgG1，κ加入到与针对CD11b（0.1mg / ml）的初级抗体相同浓度的切片中来制备同种型特异性对照。表2中列出的同种型对照的浓度为0.5mg / ml，应在2.5％NHS中1：500稀释，并在4°C孵育过夜，摇动（图4A）。
  2. 为了确定由组织标本的背景染色产生的信号，应该不包括一次抗体对照。通过在2.5％NHS中单独覆盖切片（省略任何抗体）并在4°C孵育过夜，摇动（图4B）来制备无一抗抗体。
  3. 为了鉴定使用CD68的巨噬细胞，在该步骤（表2）（图2A）中用CD68替代抗CD68一抗（1：100稀释）以用于抗CD11b的一级抗体。
  4. 为了鉴定特定的M2巨噬细胞群，在本步骤中用1:50稀释的抗CD163一抗替代抗CD11b一抗，并按照书面（表2）继续染色方案。
  5. 为了鉴定卫星细胞群体，在此步骤（表2）中应该用1：100稀释的抗Pax7抗体替代针对CD11b的第一抗体。
21. 从切片中取出第一抗体并洗涤（如上述步骤C17所述）四次，用1x PBS洗5分钟，在室温下摇动。
22. 将过量的1x PBS倒在纸巾上，轻弹以除去剩余的1x PBS，用纸巾擦拭载玻片的背面，返回到载玻片室。
23. 加入生物素化的山羊抗小鼠IgG1，在2.5％NHS中以1：1,000稀释，并通过在室温下摇动90分钟进行孵育。
24. 删除生物素标记的抗体，并重复步骤C21和C22中的洗涤。
25. 加入1：500稀释的SA-HRP，孵育60分钟，在室温下摇动。
26. 从切片中取出SA-HRP并洗3次，用1x PBS洗5分钟，在室温下摇动。
27. 第三次洗涤后，重复步骤C22，然后加入TSA 488，在1x PBS中以1:500稀释，孵育20分钟，在室温下摇动。
28. 移除TSA 488并在步骤C26中重复清洗
29. 重复步骤C15-C18以阻止用于标记CD11b的链霉亲和素和生物素，并防止假共染色。
30. 添加足够的2.5％NHS体积以完全覆盖切片并在RT下摇动至少60分钟（如果需要，切片可以留在2.5％NHS中）。
31. 取出2.5％NHS，用Kimwipe轻轻擦拭PAP笔以重新建立疏水屏障，加入CD206的第一抗体，在2.5％NHS中以1：200稀释，然后使载玻片室在4℃下回到摇床过夜。
  为了确定由组织标本的背景染色产生的信号，在该步骤中也不应包括一次抗体对照。通过在2.5％NHS中单独覆盖切片（省略任何抗体）并在4℃孵育过夜来摇动（图4C）来制备无一抗抗体。
32. 从部分中移除CD206抗体并重复步骤C21和C22进行清洗。
33. 加入生物素化的兔抗山羊IgG，在2.5％NHS中以1:500稀释，并在室温孵育90分钟，摇动。
34. 从切片中取出生物素，洗涤4次，用1x PBS洗5分钟，在室温下摇动。
35. 添加SA-594，在1x PBS中1：200稀释，孵育60分钟，在RT摇摆。
36. 从切片上取下SA-594，用1x PBS清洗3次，5分钟，在室温下摇动。
37. 用DAPI孵育切片，在1x PBS中以1:10,000稀释，在RT下10分钟，摇动。
38. 从切片中取出DAPI，并用1x PBS冲洗3次，5分钟。
39. 将过量的1x PBS倒在纸巾上并加入足够量的PBS /甘油或Vectashield固定介质以覆盖切片（20-50μl/载玻片）。
40. 轻轻地将盖玻片盖在玻片上，避免在盖玻片下形成气泡。
  允许安装介质铺设盖玻片的幻灯片放置5-10分钟。
41. 在纸巾上垂直放置5分钟，从滑道中排出多余的安装介质
42. 图像肌肉部分或商店幻灯片在4°C避光，直到准备成像。
  如果玻片在4°C，黑暗中正确存放，染色将持续数月。
  
  图4.免疫组化对照验证CD11b和CD206染色的特异性。 A）没有CD206的一抗，B）CD11b的同种型对照抗体和C）CD11b或CD206的一抗不存在。 CD11b（绿色），CD206（红色）和细胞核/ DAPI（蓝色）。比例尺= 100μm。所有图像都使用相同的曝光设置，从同一样品的连续部分采集20倍物镜。所有图像都应用了相同的显示调整。 A.当未将CD206的一抗应用于切片时显示缺乏CD206染色的图像。该对照显示了CD206抗体的特异性;染色不是与用于扩增CD11b或由于非特异性组织染色的试剂交叉反应的产物。 B.当应用同种型对照抗体时缺乏CD11b +染色。与A组类似，该对照显示了CD11b抗体的特异性，因为同种型匹配的对照不产生非特异性染色。另外，该对照显示CD206染色不是由与CD11b试剂的交叉反应性导致的，因为不存在CD11b染色，但是CD206 +细胞被清楚地鉴定。 C.图像显示来自使用扩增试剂的骨骼肌组织切片的非特异性背景染色非常低;因此阳性巨噬细胞染色可以清楚地区分组织背景。

数据分析

骨骼肌纤维数量和巨噬细胞丰度的定量＆nbsp;

骨骼肌巨噬细胞分析的一般准则
1. 要分析巨噬细胞数量的部分应该包含至少50-100骨骼肌纤维。
2. 非特异性染色在骨骼肌部分的边缘周围是常见的;因此，在计数巨噬细胞时排除边缘。
3. 不要在要计数的区域包括纵向骨骼肌纤维;这会扭曲巨噬细胞/纤维的数量。
4. 有时会在受损组织中观察到含有血斑，水肿或纤维化的区域（图5B）。这些区域通常充满巨噬细胞，不应该与位于骨骼肌纤维之间的巨噬细胞进行相同的分析（图5A）。这些巨噬细胞是否应该量化取决于研究的目的。
图5.显示巨噬细胞染色的代表性图像：CD11b（绿色），CD206（红色）和DAPI（细胞核，蓝色）。图5.巨噬细胞在人外侧肌中大量共表达CD11b和CD206。。大多数巨噬细胞对于CD11b和CD206都是阳性的;然而，可以观察到CD11b + / CD206-巨噬细胞（白色箭头）。比例尺= 100μm。 B.来自股外侧肌的肌肉切片显示CD11b + / CD206 +（黄色箭头）和两个CD11b + / CD206-（白色箭头）单核细胞。注意在更大的视野中（右图），CD11b + / CD206-单核细胞位于肌肉切片边缘的一块血液中，证实CD206是人骨骼肌中组织驻留巨噬细胞的可靠标记。可以通过其干燥的裂纹外观和高红色背景信号（在用虚线表示的部分中的血斑和肌纤维之间的边界）来识别血斑。灰色的X标记了一个区域，该区域具有由该区域下方的气泡产生的绿色背景信号（进一步在图S1 ）。比例尺= 50微米。 C.条形图定量显示每100个骨骼肌纤维中总巨噬细胞（所有CD11b +）和CD11b + / CD206 +巨噬细胞的数量。分析来自股外侧肌的65个肌肉活组织检查。每个点代表来自单个受试者/部分的总CD11b +和CD11b + / CD206 +组之间重叠的巨噬细胞计数，说明大多数巨噬细胞（总CD11b +）也表达CD206（CD11b + / CD206 +）。在骨骼肌样品中，大约82％的总巨噬细胞群体共表达CD11b和CD206。
调整任何通道中的图像显示，以便背景染色可见，并且可以区分单独的骨骼肌纤维（图6A-6B）。
使用Zen图像捕捉软件中的“事件”工具手动计算感兴趣区域内总骨骼肌纤维的数量，以划分单个骨骼肌纤维（图6C-6D）。

图6.横截面内骨骼肌纤维数量的图像调整和计数A.在操作显示设置之前的原始图像; B.调整显示器后的相同图像以增加可见的背景染色，允许对骨骼肌纤维进行鉴定和计数; C.单个肌纤维的数量，由黄色Xs表示; D.手动勾画纤维以帮助划分单个骨骼肌纤维边界（白色）以及来自面板C（黄色X）的纤维计数。 A-D）CD11b（绿色），CD206（红色），细胞核/ DAPI（蓝色）。比例尺= 100μm。
调整图像显示，以便清晰地观察CD11b +巨噬细胞（绿色）和DAPI +细胞核（蓝色），并且细胞形状/形态明显不同（图7A-7B）。
1. 应使用抗体特异性的同种型特异性染色对照来帮助确定适当的显示调整以鉴定真阳性染色（图5A）。
2. 对于抗体/扩增试剂的非特异性结合，可以使用一级抗体染色对照来帮助确定背景组织染色和计数显示调整（图4B-4C）。
图7.识别和量化骨骼肌横切面内的巨噬细胞A.代表人体股外侧肌巨噬细胞染色的图像：CD11b（绿色），CD206（红色）和细胞核/ DAPI（蓝色））。 B.显示A组中图像的调整显示足够的组织背景染色以清楚地识别来自非特异性组织染色的巨噬细胞。 C.巨噬细胞计数，用有色X标定：所有CD11b +（绿色Xs），所有CD206 +（红色Xs），CD11b + / CD206 +巨噬细胞都标有绿色和红色X.白色箭头表示看起来具有阳性染色的区域，在DAPI附近，但由于尺寸和/或缺乏细胞结构的独特形态特征决定因素而未被计数。其他区域由于缺乏DAPI染色（黄色箭头）而未被计数。比例尺= 100μm。
使用DAPI作为细胞标记，手动识别并计数位于DAPI附近的CD11b +巨噬细胞总数（下文
巨噬细胞计数注释部分进一步解释）（图7C）。
1. 骨骼肌巨噬细胞在形态学上是不均匀的（图8A-8D）。对于巨噬细胞计数，我们不区分不同的形态组（即，所有CD11b + / CD206 +巨噬细胞都统计在一起，无论形态如何）（见一般注释4）。
2. 如果DAPI不存在于染色附近，即使形态看起来很明显，我们也不会将染色计数为阳性事件。
3. 染色的尺寸必须足够大以代表细胞结构（至少与完整细胞核的尺寸相同，>5μm） - 小点/贴片通常只是第二抗体对细胞碎片的非特异性染色。 />
4. 在不能区分单个巨噬细胞的斑块中，手动计数每个接触巨噬细胞染色的DAPI +细胞核（图9A-9D）。
图8.不同的骨骼肌巨噬细胞形态A.来自股外侧肌的代表性图像显示具有典型形态学的巨噬细胞。在其他组织中描述，静止巨噬细胞的突出过程被认为是监视当地环境（Olah等人，2011，Durafourt等人，2012）。 B.向第二CD11b + / CD206-巨噬细胞伸展的CD11b + / CD206 +巨噬细胞（顶部）（底部）。 C.圆形或变形虫形巨噬细胞。在其他组织中，这种形态被认为是活化和炎性细胞因子产生的指示（Olah等人，2011，Durafourt等人，2012）。 A-C）比例尺=20μm。 D.巨噬细胞包围受损的骨骼肌纤维（由中央核的存在表示）。比例尺= 50微米。 A-D）使用40x物镜以Z堆叠的形式获取图像并裁剪放大。 CD11b（绿色），CD206（红色），细胞核/ DAPI（蓝色）。

图9.当单个细胞聚集在一起时计数巨噬细胞A.代表性图像显示巨噬细胞染色的区域具有多个细胞核，其中不能区分单个巨噬细胞。 B.图A中的图像，其中概述了划分DAPI +细胞核接触区的阳性巨噬细胞染色。 C.包括标记每个细胞核的Xs的图B图像计数为阳性巨噬细胞染色。 D.来自图A的原始图像显示C组标记的巨噬细胞计数中的X，而没有描绘正核的轮廓。 A-D）CD11b（绿色），CD206（红色）和细胞核/ DAPI（蓝色）。比例尺= 50微米。
在计数总CD11b +巨噬细胞后，返回并手动计数也表达CD206的这些巨噬细胞的数量。
1. CD11b + / CD206 +巨噬细胞是混合的M1 / M2骨骼肌巨噬细胞群。
2. CD11b + / CD206-巨噬细胞可能代表M1群体。
为了确定M1巨噬细胞的数量，从表达CD11b +的巨噬细胞总数中减去CD11b + / CD206 +巨噬细胞的数量。这给你只有表达CD11b +（CD11b + / CD206-）的巨噬细胞的数量。
对于最终数字，将每个巨噬细胞计数除以该区域的纤维总数。

笔记

一般注意事项
1. 按照赫尔辛基宣言进行骨骼肌活组织检查。来自肯塔基大学，伯明翰阿拉巴马大学和阿肯色州中部退伍军人医疗保健系统的老年研究教育和临床中心进行的三项独立研究的骨骼肌活检被用于本协议。肯塔基大学的科目由机构审查委员会和肯塔基大学批准的协议提供了书面知情同意书。关于另外两项研究的受试者同意和方案批准的细节在以下出版物中概述：（Dennis等人，2015年，Long等人，2017年）。 br />
2. 我们已经使用这个协议来确定从19岁到83岁不等的受试者中的巨噬细胞群，并且跨越多种活动水平。我们发现共表达CD206（〜82％）的总CD11b +巨噬细胞在人口统计学上保持相对一致的百分比;然而，丰度（数量/纤维）和表型可能会受到年龄，肥胖和/或运动的影响。
3. 我们承认表面标志物表达不足以推断功能，应进一步分析以确定巨噬细胞群体的功能特征。
4. 骨骼肌巨噬细胞表现出非均质形态;然而，我们目前并未将巨噬细胞形态学作为变量分析（图8）。尽管单独形态学可能不足以区分巨噬细胞群，但我们相信巨噬细胞形态学可能是一些重要的研究变量，并可能进一步提供超出表面标志物表达的巨噬细胞表型的观察。
5. 切片后干燥时间取决于样品的大小，但3-4小时通常足够用于骨骼肌活组织检查。干燥后，如果稍后进行染色，可将载玻片保存在-20°C。
6. 如果样品储存在-20°C，在丙酮固定之前，应使载玻片升温至室温15-20分钟。
7. 如果在一项研究中的不同时间点进行多组染色，应该包括批次控制，并应包括至少一个对照和一个实验样本。
8. 对于移液器上移动的所有试剂，使用足够的体积来覆盖这些部分，并用PAP笔填充您创建的区域，通常在200和500μl/ slide之间。
9. 在与3％过氧化氢孵育过程中，可能会在截面上看到气泡形成，表明过氧化氢正在工作;缺少起泡不会影响染色结果，但表示组织质量差。
10. 在步骤C26之后，载玻片可以用PBS /甘油盖上盖片，并且在向前移动方案之前可以检查染色。在带有1x PBS的Coplin瓶中孵育载玻片以去除盖玻片（它们将脱落），用1x PBS洗涤2或3次并继续步骤C27。
11. 排水滑盖后盖玻片：
  1. 载玻片应该足够的排空，使得载玻片不再从盖玻片下方泄漏，并且盖玻片紧紧地粘合到玻片上。
  2. 注意不要过度排出幻灯片;这将导致在盖玻片下形成气穴。
  3. 对于长期存放，幻灯片可以安装Vectashield安装介质。
  4. 可以通过用指甲油涂抹盖玻片的边缘来密封玻片，以防止随着时间的推移在盖玻片下面形成气穴。
12. CD11b和CD68抗体都是小鼠IgG1同种型，都需要使用Superboost酪胺信号扩增试剂进行扩增。由于这些原因，CD11b和CD68的共染色是不可能的（假阳性双染色发生）。
13. 通过用CD163第一抗体（参见表1）代替CD11b第一抗体并按照书面的剩余方案，可以修改该方案以鉴定表达CD163的CD206 +巨噬细胞的亚组。
14. Pax7的一级抗体（见表1）可以替代CD11b一级抗体来标记卫星细胞;其余协议步骤是相同的（图10）。
  
  图10.骨骼肌干细胞（卫星细胞）可以弱表达CD206，但很容易与巨噬细胞区分开来。A.来自人体股外侧肌的代表性图像显示Pax7 +卫星细胞（绿色，B），CD206 +巨噬细胞（红色，C）和Pax7 + / CD206弱卫星细胞（D）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺= 100μm。 B-d。放大A组方框的放大倍率。注意当调节强度以使卫星细胞中的CD206表达可见时，CD206巨噬细胞染色（C）的过度曝光（D）。作为Z堆叠的图像以40倍物镜获取。比例尺= 20μm。 E.来自人体股外侧肌的高倍放大图像显示紧邻Pax7 +卫星细胞（绿色）的CD206 +肌肉巨噬细胞（红色）。细胞核用DAPI染色，骨骼肌纤维边界用层粘连蛋白染色（均为蓝色）。图像是作为Z堆栈与100倍油目标获得的。比例尺= 20微米。
巨噬细胞计数笔记
1. 应正确调整图像捕捉以便于识别巨噬细胞。
  1. 应设置暴露时间，使巨噬细胞和核形态清晰可辨，背景染色尽可能最小化。
  2. 应以20倍物镜或更高放大倍数获取图像。
  3. 对于拼接图像：
    1. 使用DAPI染色找到组织切片的边缘是最容易的部分边界。
    2. 使用FITC通道（CD11b染色）对焦点最好设置，以确保巨噬细胞聚焦清晰的形态。
2. 染色必须位于DAPI附近（5μm以内），但不一定要直接在DAPI染色之上。如果形态学是一种巨噬细胞，并且它接近但不接触DAPI，我们将把事件计数为巨噬细胞（图7）。
3. 我们发现CD163 +巨噬细胞构成了总CD206 +巨噬细胞的一个子集。因此，如果量化这些人群，应将CD206 +巨噬细胞计数为“亲代”巨噬细胞群（类似于上述CD11b）。
4. 在分析数据集之前建立一套计数参数对量化巨噬细胞有帮助，并有助于减少计数器之间的差异。
5. 选择一些图像作为“指导”计数设置，并使用这些图像为巨噬细胞如何识别以及培训新计数器设置指导。
  1. 在确定巨噬细胞方面，图像，小组和研究之间保持一致非常重要
  2. 在一个数据集中，由于计数器之间的差异，最好使用相同的盲法计数器来分析整个数据集。
  3. 我们发现，虽然计数器之间的绝对数量有所不同，但如果概述并遵循基本指导原则，则巨噬细胞数量增加或减少的整体趋势仍然保持一致。

食谱

1×PBS（10mM，pH7.4）
1. 混合69.68g NaCl，17.36g Na 2 HPO 4·7H 2 O，2.08g KH 2 PO 4， sub> 4
2. 搅拌溶解在去离子水中
3. 用去离子水稀释10N氢氧化钠1：5制成2N溶液;
  用去离子水稀释6 N HCl 1：3，制成2 N溶液
4. 用2N NaOH或HCl调节1x PBS的pH值
5. 带来8升的最终音量
6. 1x PBS可保存在室温下3个月
3％过氧化氢

在1x PBS中稀释30％过氧化氢1:10
DAPI染色细胞核
1. 用1x PBS稀释制备5 mg / ml的储备溶液
2. 分装并储存在-20°C
3. 1×PBS中1：10,000的工作稀释度用于标记核

致谢

这项工作得到了国家老化研究所（AG046920）和美国国立卫生研究院临床和转化科学奖（CTSA）（UL1TR001998）在肯塔基大学的支持。这项工作还利用从美国退伍军人事务部（VA）Rehabilitation R＆amp; D服务部的Richard A. Dennis获得的通过优异评审奖＃RX0012030获得的去识别样品。内容不代表VA或美国政府的意见。作者要感谢Sami Michaels在量化图5所示的巨噬细胞方面提供的帮助。我们还要感谢Doug Long在肯塔基大学招聘研究课题。在英国流式细胞术＆amp;公司的帮助下收集多通道流式细胞术。细胞分选核心设施（ www.research.uky.edu/core/flow ）。英国流式细胞仪＆amp;细胞分选核心设施部分由研究副总裁办公室，马基癌症中心和NCI中心核心支持资助（P30 CA177558）为肯塔基大学Markey癌症中心提供支持。

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