材料和试剂

耗材
1. 一次性培养皿（VWR，目录号：89022-320）
2. 移液器吸头（Corning，Axygen ，目录号：T1005WBCRS; Biotix，目录号：M-0200-1RCNS）
3. Parafilm（VWR，目录号：52858-000）
  制造商：Bemis，目录号：PM996。
4. 接种环（Globe Scientific，目录号：130118）
5. 离心管2.0 ml（Corning，Axygen <\ sup>，目录号：MCT-200-C-S）
6. 离心管1.5毫升（VWR，目录号：20170-038）
7. 离心管50毫升（康宁，目录号：352098）
8. 手术刀片（Integra LifeSciences，目录号：4-110）
9. 玻璃珠（Propper，目录号：03000600）
10. 刮纸器（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
11. 96孔板（Corning，目录号：351172）
12. 细胞刮刀（VWR，目录号：89260-222）
13. 托盘（Thermo Fisher Scientific，Nunc，目录号：242811）
植物
Zea mays cv。糖包F1（se +）（约翰尼的精选种子，目录编号：267）
细菌菌株
嗜麦芽窄食单胞菌ZK5342，垂体短肠杆菌 ZK5343，

阴沟肠杆菌ZK5344，阴沟肠杆菌ZK5345， Chryseobacterium indologenes ZK5346， Herbaspirillum frisingense ZK5347和
恶臭假单胞菌 ZK5348（牛和科尔特，2017）
这些毒株可通过电子邮件申请： ben_niu@nefu.edu.cn 或 roberto_kolter@hms.harvard.edu
真菌菌株
Fusarium verticillioides MRC826（Hinton and Bacon，1995）
化学试剂
1. 乙醇（Decon Labs，目录号：V1001）
2. 漂白剂（Janitorial Supplies，Clorox ，目录号：CLO30966CT）
3. 没有葡萄糖的Bacto TM Tryptic大豆肉汤（BD，目录号：286220）
4. Soyabean酪蛋白消化琼脂（HiMedia实验室，目录编号：GM290-500G）
5. 琼脂（BD，目录号：214010）
6. 10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：17-517Q）
7. Murashige和Skoog Basal盐混合物（MS）（Sigma-Aldrich，目录号：M5524-50L）
8. 萘啶酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：N8878-5G）
9. 粘菌素（Sigma-Aldrich，目录号：C4461-100MG）
10. 林可霉素（Sigma-Aldrich，目录号：62143-1G）
11. 金霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C4881-5G）
12. 红霉素（Sigma-Aldrich，目录号：E5389-1G）
13. 万古霉素（Sigma-Aldrich，目录号：75423-5VL）
14. 亚氯酸钠（VWR，目录号：BDH9286-500G）
15. Novobiocin（Sigma-Aldrich，目录号：N1628-1G）
16. 妥布霉素（Sigma-Aldrich，目录号：T4014-100MG）
17. 葡萄糖（VWR，目录号：BDH9230-500G）
媒体和缓冲区（请参阅食谱）
1. 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
2. 0.1x胰蛋白胨大豆琼脂培养基
3. 胰蛋白酶大豆肉汤培养基
4. 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
5. ½Murashige和Skoog（MS）琼脂培养基
6. 用于S的选择性媒体。麦芽糖杆菌 ZK5342
7. 用于 O的选择性媒体。垂体瘤 ZK5343
8. 用于 C的选择性媒体。 pusillum ZK5344
9. E的选择性媒体。阴道菌 ZK5345
10. 用于 C的选择性媒体。 indologenes ZK5346
11. 用于 H的选择性媒体。 frisingense ZK5347
12. 用于 P的选择性媒体。 putida ZK5348
13. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
14. 水琼脂培养基

设备

镊子
移液管（Gilson，型号：P20，P200和P1000，目录号：F123600，F123601和F123602; Thermo Fisher Scientific，型号：F1-ClipTip TM，目录号：4661140N和4661130N）
II级生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，型号：Herasafe TM KS9）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
涡流（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：G560）
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 640）
Sonicator（Qsonica，型号：Q125，目录号：Q125-110）
余额（梅特勒 - 托利多国际，目录号：AG135）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1492）
显微镜（ZEISS，型号：Axioscop 2 plus）
立体镜（蔡司，型号：Stemi SV 6）

软件

RStudio（版本0.99.903）
QIIME（版本1.6.0）
PRISM（版本6.0c）

程序

玉米种子的表面灭菌和萌发
1. 挑选10个完整无病症状的玉米种子，用镊子将它们放入培养皿（直径9厘米）（图1A）。
2. 将种子浸入70％（v / v）乙醇中3分钟，然后除去乙醇。
3. 将种子浸入5％（v / v）漂白剂中3分钟，然后除去漂白剂。
4. 用无菌蒸馏水冲洗种子三次。
5. 从第三次冲洗中取250μl水，涂在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上，以检查是否有污染。
6. 在30°C孵育TSA板过夜
7. 如果TSA平板上不存在微生物菌落，则继续下列步骤，否则，丢弃玉米种子并重复步骤A1至A6，直到TSA平板上检测不到菌落。
8. 从含有玉米种子的培养皿中取出蒸馏水。
9. 保持种子的胚胎并用7ml无菌蒸馏水填充培养皿（图1B）。
10. 将含有表面灭菌种子的培养皿置于30°C黑暗处。
11. 孵育24小时后，从培养皿中取250μl水，铺在TSA平板上检查是否有污染。
12. 在30°C孵育TSA板过夜
13. 如果TSA平板上不存在微生物菌落，则继续下列步骤，否则，丢弃玉米种子并重复步骤A1至A12，直至TSA平板上未检测到菌落。
14. 从培养皿中取出水并加入7 ml无菌蒸馏水。
15. 在30°C下将培养皿放回黑暗中。
16. 总共培养50至55小时后，选择1-2厘米根发芽的玉米种子（图1C），以进行以下步骤。
  注意：在生物安全柜中执行步骤A2至A17。
玉米幼苗接种细菌群落
1. 将七种细菌菌株（嗜麦芽窄食单胞菌ZK5342，垂颈短杆菌ZK5343，革囊霉Cukobacterium pusillum ZK5344，阴沟肠杆菌ZK5345，阴性杆菌ZK5346，Herbaspirillum frisingense ZK5347和恶臭假单胞菌ZK5348），并在30℃下温育24-48小时。
2. 接种5ml胰蛋白大豆肉汤（TSB）中的每种菌株的单菌落并在30℃以120rpm摇动过夜。
3. 将每种菌株的50μl过夜培养物转移至5ml新鲜的TSB中，并在30℃再振荡8小时。
4. 收集细胞在2.0毫升管中，通过在2,940×gg离心10分钟在4℃。
5. 在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重悬细胞并将每种菌株的细胞悬液稀释至每毫升〜10 8个细胞（表1）。
  
  表1. 0 0 strong> 每个菌株对应t 0 > 8 cells / ml
6. 将各菌株的细胞悬浮液以等体积混合在50ml Falcon管中以制备多种物种（分别由去除七种物种中的每一种产生的七种或六种）细菌悬浮液。
7. 在培养皿中的30ml多种细菌悬浮液（图1D）中浸泡不超过30个具有1-2cm主根的表面灭菌和发芽的玉米种子（图1C），而不在室温下摇动0.5-1.0小时。移动种子以确保根部完全浸没在悬浮液中。将另外10个经表面灭菌和发芽的种子在1x PBS缓冲液中浸泡0.5-1.0h并用作对照。
8. 将由细菌和无菌种子粘附的玉米种子通过无菌镊子转移到玻璃管（16×150mm）中的20ml 1/2 Murashige和Skoog（MS）琼脂（0.8％）上。用镊子轻轻按压种子，将主根插入琼脂中（图1E）。使用相同尺寸的无菌空玻璃管以口对口的方式关闭含种子的试管。通过石蜡膜连接并固定两个管（图2A）。
  
  图1.玉米种子A.干种子; B.表面消毒后的种子; C.表面灭菌和发芽的种子; D.在培养皿中浸泡在多种细菌物种的悬浮液中的表面灭菌和发芽的种子; E.表面灭菌和发芽的种子，有/无细菌，坐在半琼脂琼脂上。比例尺= 1厘米。
  
  图2.无菌玉米幼苗的生长A.双管生长室。封口膜用于将两个玻璃管固定在一起。 B.在双管生长室中生长的不同年龄的无菌玉米幼苗。
9. 在下列条件下将玉米幼苗置于双管室中：16小时光照（天）和8小时黑暗（夜间），4000lx，25℃和54％的相对湿度。
  保持玉米苗在上述条件下15天。
  注意：在生物安全柜中或靠近火焰执行步骤B1至B8。
量化定殖在玉米根上的细菌群落的组成
1. 在接种后的第5天，第10天和第15天，用八个细菌群落中的每一个（一个七种群和七个六种群落）接种三到五个玉米幼苗。
2. 用无菌手术刀片切割每个玉米幼苗的根部（视频1）。
  
  视频1
3. 在无菌1x PBS缓冲液中迅速冲洗根部以除去琼脂粘附在根表面。
4. 用无菌手术刀切割主根，收获玉米籽粒下方1厘米长的主根碎片。
5. 用无菌手术刀片取出根部的侧根
6. 将根碎片转移到1.5毫升的离心管中，加入两个无菌200-μl移液器吸头。
7. 将6个玻璃珠（直径：3 mm）放入试管中，并加入1 ml无菌1x PBS缓冲液。
8. 通过超声处理（幅度：30％;脉冲：在01秒，关闭01秒;时间：30秒）下移动定殖在根表面上的细菌细胞1分钟，然后通过涡旋另外1分钟。
9. 重复步骤C8两次。将试管放在冰上1分钟。
10. 在96孔板（视频2）的一个泳道（8孔）中加入180μl无菌1x PBS缓冲液。
  
  视频2
11. 将步骤C9中获得的20μl细菌悬浮液置于泳道的第一个孔中，并通过吸吮并用移液管排除混悬液进行混合。
12. 用一把镊子取出根部碎片，用擦纸器擦干碎片，然后称重到天平上并记录碎片的重量。
13. 从第一个到第八个孔顺序转移20μl混合好的细菌悬浮液，以获得细菌悬浮液的10至10 8倍稀释度。
14. 从8个孔中的每一个中取10μl稀释的细菌悬液，用多通道移液管在每个菌株的3个选择性0.1x TSA平板（表2）上点出来。
  
  表2.每种菌株的选择培养基和培养时间的补充
15. 倾斜平板使细菌悬液滴向一个方向移动，将细胞铺展在琼脂表面上。
16. 空气干燥选择性0.1x TSA板与细菌悬浮液
17. 将培养板在30°C黑暗中培养16至60小时（表2）。
18. 计数并记录选择性平板上的菌落形成单位（CFU）数量（图3A）。
19. 使用10到200之间的CFU数字（图3B）来计算细菌丰度：
  
  图3.简化群落中7种细菌菌落的菌落A.在普通和选择性0.1xTSA上生长的7种细菌菌株各自菌落的形态板。 'P'和'S'分别表示纯0.1x TSA板和选择性0.1x TSA板。 B. O的殖民地。在选择性平板上生长的pituito m 。从左至右，通过10 4 - ，10 - 3 - ，10 - 2 - 细胞的生长形成四条菌落， - 和10倍稀释的细菌悬液。
  两个泳道的CFU（菌落形成单位）数量适合细菌的定量分析。
20. 计算社区中每个物种的相对丰度。
体内测定细菌群落对抗F的抑制作用。 verticillioide s
注意：在生物安全柜内或靠近火焰处执行步骤D1至D10
1. 放置一个 F。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板的中心处直径为0.5厘米的MRC826菌丝盘，以及马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中心的直径为0.5厘米的MRC826菌丝盘和在28°C孵育7天，直到菌丝体覆盖整个平板。
2. 将20ml无菌1x PBS缓冲液置于 F中。生长在PDA琼脂平板上的verticillioid s 菌落。
3. 用细胞刮刀收获新鲜的孢子
4. 过滤 F。 verticillioid e s 通过八层无菌纱布悬浮孢子。
5. 稀释孢子悬浮液，用显微镜下的血细胞计数器计数孢子。
6. 调整孢子浓度至每毫升无菌0.01％（vol / vol）Tween 20〜10 8孢子。将悬浮液储存在4°C。
7. 将悬浮液稀释至每毫升无菌1x PBS缓冲液〜10 6孢子。
8. 通过铺展在含有20ml 2.25％（wt / vol）水琼脂的托盘上（〜10 3 CFU / cm 2）接种孢子。
9. 将10种表面灭菌的玉米种子（图1B）浸泡在7种细菌群落的30ml悬浮液中，每种单一种类的群落或埃希氏菌 c DH5α在培养皿中用于＆lt; span style =“font-size：10pt;”> 0.5-1.0 h。将另外10个表面灭菌的种子在无菌1×PBS中浸泡0.5-1.0小时并用作对照。
10. 用无菌镊子将种子放在托盘中的水琼脂表面上。
11. 将托盘在23°C的黑暗中放置10天。
12. 计数并记录每天每次治疗中显示可见真菌菌丝体的种子数（图4A）。计算真菌定殖率为：
13. 使用解剖显微镜孵育后第4天和第10天，拍摄每个种子表面的菌丝体生长情况（图4B）。
  
  图4.与7种简化细菌群共同接种的玉米幼苗和 F。 A.一种十日龄的玉米幼苗，接种有在水琼脂上生长的细菌群落，并带有真菌孢子。琼脂上的白色斑点是由孢子发育而来的菌丝体。 B.由两条黄色虚线表示的（A）中种子的增大。
  种子上的白色毛发是种子表面的菌丝体（比例尺= 2毫米）。
14. 通过基于先前描述的等级计算疾病严重程度指数（牛痘e抗体），在第10天评估每次治疗的玉米幼苗枯萎病的严重性。（Sherwood and Hagedorn，1958）：
  。，2017）
  
  这些疾病的排名如下：
  等级1 =在核仁表面没有可见的真菌菌丝体生长，并且根部存在褐色病变;
  等级2 =核仁表面被真菌菌丝体部分覆盖，并且根部存在褐色病斑;
  等级3 =内核的表面被真菌菌丝体部分覆盖，并且在根上存在棕褐色至棕色病变;
  等级4 =内核的表面被真菌菌丝体完全覆盖，并且在根上存在棕褐色至棕色病变;
  等级5 =内核的表面被真菌菌丝体完全覆盖，并且在根上存在红棕色病变（Ni-em-em-t a l 。，2017）。

数据分析

Bray-Curtis（BC）不相似性指数是根据每个物种的相对丰度值通过RStudio的包装素食（版本0.99.903）的函数计算的。然后使用差异矩阵通过使用R包'gplots'的函数'hclust'的等级聚类来生成相应的聚类树状图。在每个六种群落的玉米根上的社区与群落中的社区之间的BC距离使用QIIME（版本1.6.0）计算接种七种模型群落的根。 Fisher's LSD测试（PRISM，版本6.0c）用于比较：1）。每个六种群落与七种群落植物模型社区植物之间的BC距离，2）。用F em处理的玉米幼苗的真菌定植率和疾病严重性指数。 verticillioid e s 单独与 F 一起使用。 verticillioid e s 和七种模型社区，与 F 共同组成。 verticil l ioide s 以及七个物种中的每一个，并与F一起。 verticillioide s 和。 col i DH5α。

食谱

胰蛋白胨大豆琼脂培养基
20克胰蛋白胨大豆琼脂（HiMedia实验室）
1000毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
0.1x胰蛋白胨大豆琼脂培养基 1.38克不含葡萄糖（BD）的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂（BD）
500毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
胰蛋白酶大豆肉汤培养基
13.75克胰酶大豆肉汤没有葡萄糖（BD）
500毫升蒸馏水＆nbsp;
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
100毫升PBS（10倍）不含钙或镁
900毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
½Murashige和Skoog（MS）琼脂培养基
2.15克Murashige和Skoog Basal盐混合物（Sigma-Aldrich）
4克琼脂（BD）
500毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
用于S的选择性媒体。麦芽糖 i a ZK5342
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121℃高压灭菌20分钟。将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入300μl新生霉素（Sigma-Aldrich）（100mg / ml）和12.8μl妥布霉素（Sigma-Aldrich）（39.1mg / ml）
用于 O的选择性媒体。垂体瘤 ZK5343
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入200μl粘菌素（Sigma-Aldrich）（10mg / ml），125μl红霉素（Sigma-Aldrich）（20mg / ml）和70μl万古霉素（Sigma-Aldrich）（100mg / ml）
用于 C的选择性媒体。 pusillu m ZK5344
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入1,132μl萘啶酮酸（Sigma-Aldrich）（5mg / ml），226.4μl粘菌素（Sigma-Aldrich）（10mg / ml）和66ml NaCl（VWR International）（30％，wt / vol） />
E的选择性媒体。阴道菌 ZK5345
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121℃高压灭菌20分钟。将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入163.77μl红霉素（Sigma-Aldrich）（20mg / ml）和155.07ml NaCl（VWR International）（30％，wt / vol）
用于 C的选择性媒体。 indologen e s ZK5346
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121℃高压灭菌20分钟。将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入120.19μl金霉素（Sigma-Aldrich）（10 mg / ml）
用于 H 的选择性媒介。 frisingense ZK5347
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121℃高压灭菌20分钟。将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入1000μl萘啶酮酸（Sigma-Aldrich）（5mg / ml），200μl粘菌素（Sigma-Aldrich）（10mg / ml）和1,000μl林可霉素（Sigma-Aldrich）（50mg / ml） >
用于 P的选择性媒体。 puti d a ZK5348
1.38克不含葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤
7.5克琼脂
500毫升蒸馏水
在121℃高压灭菌20分钟。将无菌培养基冷却至60°C左右。然后加入500μl萘啶酸（Sigma-Aldrich）（5mg / ml）和125μl红霉素（Sigma-Aldrich）（20mg / ml）。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
200克马铃薯块茎马铃薯提取物
17克琼脂（BD）
20克葡萄糖（VWR国际）
1000毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟
水琼脂培养基

11.25克琼脂 500毫升蒸馏水
在121°C高压灭菌20分钟

致谢

我们感谢Yue Liu帮助拍摄视频;沉博帮助培育玉米幼苗;和Kolter实验室的成员提供宝贵的建议。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款号为GM58213（至R.K.）和东北林业大学启动科学基金JQ2017-02（至B.N.）的支持。这个协议是根据Niu em em t t em em一a em em em e l l em em e l em em e l em e l e em em e em em e l e（em）（2017）修改的。作者没有利益冲突或竞争利益声明。

参考

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