材料和试剂

200μl移液管吸头（FCR＆amp; Bio，目录号：AG-200-FP-Y）
1000μl移液管吸头（FCR＆amp; Bio，目录号：AG-1000B）
1.5 ml微量离心管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：131-815C）
50 ml离心管（Corning，目录号：430291）
具有0.22μm孔径的过滤器单元（Shimadzu，目录号：GLCTD-MCE1322）
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
酵母细胞培养基
超纯水（Milli-Q）
冰
乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物（NACALAI TESQUE，目录号：15111-45）
氢氧化钠（NaOH）（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-04265）
1-庚烷磺酸盐（NACALAI TESQUE，目录号：31528-92）
磷酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：162-20492）
甲醇（NACALAI TESQUE，目录号：21929-23）
干燥酵母提取物（NACALAI TESQUE，目录号：15838-45）
Hipolypepton（NIHON PHARMACEUTICAL，目录号：392-02115）
D - （+） - 葡萄糖（NACALAI TESQUE，目录号：16805-35）
Aureobasidin A（Takara Bio，目录号：630499）
99.5％乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：14713-95）
琼脂粉（NACALAI TESQUE，目录号：01028-85）
标准缓冲溶液（pH 4.01）（NACALAI TESQUE，目录号：37219-75）
标准缓冲液（pH 6.86）（NACALAI TESQUE，目录号：37220-35）
标准缓冲溶液（pH 9.18）（NACALAI TESQUE，目录号：37221-25）
YPD中（见食谱）
Aureobasidin A储备液（见食谱）
500 mM EDTA（见食谱）
100 mM EDTA（见食谱）
HPLC流动相（见食谱）

设备

Micropipetter（容量范围20-200μl）（Nichiryo，型号：NPX-200）
Micropipetter（体积范围100-1,000μl）（Nichiryo，型号：NPX-1000）
座式加热器（ASTEC，型号：BI-516C）
铝微管架（生物医学科学，型号：BMS-D081）
离心机（KUBOTA，型号：3740）
用于1.5ml微量离心管的离心机转子（最大容量为21,880×g）（KUBOTA，型号：AF-2236）
用于50ml离心管的离心机转子（最大容量为22,140×g）（KUBOTA，型号：AF-5004CH）
玻璃试管（NICHIDEN RIKA GLASS，型号：101015）
带挡板锥形瓶（AGC TECHNO GLASS，型号：4551FK200R）
硅胶海绵锥形塞封（信越聚合物，型号：T-19）
硅胶海绵封口（信越聚合物，型号：C-40）
分光光度计（岛津，型号：UVmini-1240）
分光光度计池（Hellma，型号：104-10-40）
高效液相色谱系统（岛津，型号：Pro minence）
Octa癸基甲硅烷基（ODS）柱（YMC，型号：YMC-Pack ODS-A）
电子秤（梅特勒 - 托利多国际，型号：XS105DU）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
制冰机（HOSHIZAKI，型号：CM-100K）
深冷冻机（温度范围：-20至-30°C）（Panasonic，型号：MDF-U539）
深冷冻机（温度范围：-50至-85°C）（PHC，型号：MDF-U33V-PJ）
pH计（Horiba，型号：F-52）
强制空气流动烤箱（东京Rikakikai，型号：WFO-1210）
一次性回路（AS ONE，型号：6-488-02）
固体预培养培养箱（Sanyo，型号：MIR-153）
液体预培养培养箱（TAITEC，型号：BR-43FL·MR）
谷胱甘肽生产培养箱（TAITEC，型号：G·BR-200）

程序

谷胱甘肽生产
1. 一个S。将酿酒酵母菌株用YPD固体培养基上的一次性环划线，并在30℃生长72小时。
2. 将单个生长的菌落接种到25ml玻璃试管中的5ml YPD液体培养基中，该玻璃试管用硅酮海绵制成的锥形塞封闭。
  细菌在30℃以200rpm搅拌18小时后有氧生长。
3. 将50μl生长的酵母培养物转移到1.5ml微管中。
  加入750μl超纯水和200μl500 mM EDTA到1.5 ml微量管中并通过涡旋混匀。
4. 在EDTA溶液中测量该稀释的酵母悬浮液的OD 600。
5. 为了确定原始酵母前培养物（ODPC）的OD 600，我们将测量的OD 600乘以20（稀释因子）。
6. 将生长的细胞接种到20ml YPD液体培养基中，该培养基在用硅酮海绵封口塞住的200ml带挡板的锥形瓶中并在30℃下以150rpm搅拌长达48小时（图1）。使用下面的公式计算接种的酵母细胞培养体积（ml）。在下面的等式中，20和0.03分别表示用于谷胱甘肽发酵的YPD液体培养基的总体积（μl）和初始细胞密度（OD 600）。
7. 培养24小时和48小时后，在带挡板的锥形瓶中培养酵母培养物（1毫升）
  
  图1.谷胱甘肽生产的示意图更详细的程序在程序A中描述。
生物质浓度的测定
1. 在程序A中描述的条件下培养酵母。
2. 转移50微升的酵母培养物（生长谷胱甘肽生产）到1.5毫升微管。
  添加200μl500 mM EDTA和750μl超纯水至微管中的1.5 ml标签，并通过涡旋混匀。
3. 在EDTA溶液中测量该稀释的酵母悬浮液的OD 600。
4. 为了确定原始酵母培养物的OD 600，将测量的OD 600乘以20（稀释因子）。
5. 在50ml离心管中离心（16,000xg克，10分钟）所有酵母培养基。
6. 丢弃上清液，并添加20毫升室温超纯水的细胞沉淀，并彻底悬浮通过涡流。
7. 重复洗涤程序一次，并重新沉淀细胞。
8. 将足够体积的100mM EDTA加入细胞沉淀中以达到光密度[在细胞悬浮液的600nm（OD 600）下]约为1.0。
9. 用室温100mM EDTA稀释细胞悬液以制备2-，4-，8-和16倍稀释的细胞悬浮液，并测量这些系列稀释液的OD 600。
10. 称取空的开放的50ml离心管，并在这些管中离心（16,000×g，10分钟）20ml这些细胞悬浮液。
11. 取出上清液，在80℃的强制空气流通烤箱中培养过夜的离心管，以充分干燥细胞。
12. 用干细胞沉淀物称重每个50ml离心管，并通过从总重量中减去空管的重量来计算干细胞沉淀物的重量（图2）。
  
  图2.生物质浓度测定示意图更详细的程序在程序B中描述。
13. 构建OD 600和生物质浓度（[干细胞重量] / [L-肉汤]）的校准曲线。图3显示了校准曲线的一个例子。
  
  图3. OD浓度和生物量浓度的校准曲线示例。 S 在30℃YPD培养基中生长48小时的酿酒酵母 GCI菌株用于构建此校准曲线。
细胞浓度和细胞破坏的测量
1. 转移1毫升生长谷胱甘肽生产酵母培养在1.5毫升微管。
  加入250μl500 mM EDTA到1.5 ml微量管中并通过涡旋混匀。
2. 将50μl含有100mM EDTA的酵母培养物转移到新鲜的1.5ml微管中。
  加入950微升超纯水到1.5毫升的微管中，并通过涡旋混匀。
3. 在EDTA溶液中测量该稀释的酵母悬浮液的OD 600。
4. 为了确定原始酵母培养物（ODC）的OD 600，将测量的OD 600乘以25（稀释因子）。
5. 离心（16,000×g克，1分钟）1.2ml在100mM EDTA溶液中的残余酵母培养物，并通过涡旋将沉淀重悬于1ml超纯水中。
6. 重复洗涤程序一次，并重新沉淀细胞。
7. 根据以下公式计算出的细胞沉淀量，并加入适量的超纯水，并重新悬浮。在下面的等式中，960和35分别表示不含EDTA溶液的残余酵母培养物体积（μl）和分别对于谷胱甘肽测定最佳的OD 600分布。
8. 将980μl蒸馏水和20μl浓缩酵母细胞悬浮液转移到不同的1.5 ml微型管中并充分混合。
9. 测量该稀释的酵母细胞悬浮液的OD 600并将测量的OD 600乘以50（稀释因子）以获得OD 600浓缩的再悬浮细胞（ODR）。
10. 为了破坏酵母细胞，将浓缩的细胞悬浮液在95℃孵育3分钟，然后在冰上冷却3分钟。
11. 离心（16,000×g，10分钟）破碎的细胞悬液，并将50μl上清液（含有细胞内容物的溶液）转移到新的1.5ml微管中。在HPLC分析之前，细胞内容物溶液可以储存在-20℃（图4）。
  每个菌株至少需要三个样品进行精确测量
  
  图4.测量细胞浓度和细胞破坏的示意图更详细的程序在程序C中描述。
HPLC分析
1. 加入200μlHPLC流动相到50μl细胞内容物溶液中。
2. 过滤5倍稀释的细胞内容物溶液，通过孔径为0.22μm的过滤器，获得HPLC样品。
3. 如下设置每个参数泵：运行时间25分钟;流速，1ml / min;最大压力，20.0 MPa。
  紫外检测器：使用氘弧灯，响应时间1.0秒;内部温度，40°C;波长，210纳米。
  柱温箱：温度30℃;最高温度，40°C。
  自动采样器：进样量20μl;注射器速度，15μl/秒;冲洗量，200μl;针行程，52毫米;冲洗速度35μl/ sec;温度10°C。
4. 平衡色谱柱，使流动相以1 ml / min的流速流动至少90 min。
5. 根据HPLC手册开始分析以量化HPLC样品中还原和氧化的谷胱甘肽。图5显示了HPLC分析的例子。
  
  图5.HPLC分析的实例A.含有20mg / L GSH和GSSG的样品的HPLC分析。 B.从S中提取的样品的HPLC分析。酿酒酵母 GCI菌株细胞在YPD培养基中在30℃生长48小时。

数据分析

从ODC和OD 600和生物量的校准曲线计算细胞浓度（[干细胞重量] / [L-肉汤]）[[干细胞重量] / [L-肉汤] ]）。
通过以下公式计算细胞浓度比率：
通过以下等式计算体积谷胱甘肽产量（VGP，mg / [L-肉汤]）。在此等式中，5表示HPLC样品的稀释因子。
使用以下公式计算谷胱甘肽含量（GC）（mg / [mg-细胞]）：

笔记

如果ODS色谱柱的分离度下降，GSH和GSSG的HPLC峰变得难以分离。
在HPLC流动相中甲醇浓度的增加可以改善峰的分离。
在此协议中，需要在酵母培养基中添加EDTA以精确测量OD 600。 EDTA抑制细胞表面上的凝集素活性并因此阻止细胞聚集。如果不添加EDTA，与原始数据相比，OD 600的酵母通过聚集减少。
当向1000μl酵母培养基添加250μl500mM EDTA时，使用50μl该混合物（总体积为1250μl）测量OD 600; 1200μl这种残留混合物由960μl酵母培养基和240μl500mM EDTA组成。
在步骤C7的公式中，960的值是原始酵母培养基的剩余体积。
在许多情况下，当样品破坏前的OD 600大约为35时，HPLC样品中的GSH和GSSG浓度在校准曲线内。因此，该协议在计算超纯水的充足体积时包含了35的这个值。

食谱

YPD培养基（1升）
10克干酵母提取物
20克的hipolypeptone
20克D - （+） - 葡萄糖

1.0毫升aureobasidin A储备液（如果需要） 20克琼脂粉（如果需要）
超纯水
Aureobasidin A储备液（1 L）
0.5毫克aureobasidin A

99.5％乙醇
500 mM EDTA（1 L）

186.12克EDTA二钠盐二水合物超纯水
用1.0 M NaOH调节pH至8.0
100 mM EDTA（1 L）
200毫升500mM EDTA
超纯水
HPLC流动相（1 L）
6.12g的KH 2 PO 4 4 1.818克的1-庚烷磺酸盐
212.6毫升甲醇
超纯水

用98％磷酸调节pH值至2.8

致谢

这项工作得到了日本教育，文化，体育和科学技术部（MEXT）的促进科学和技术特别协调基金，创建先进跨学科研究领域创新中心（创新生物生产，神户）的支持。该协议是根据我们以前的作品（Hara等人，2012年，Hara等人，2015年，Kiriyama等人，2013年）改编的; Kobayashi 等，2017）。作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

Hara，K. Y.，Aoki，N.，Kobayashi，J.，Kiriyama，K.，Nishida，K.，Araki，M.和Kondo，A。（2015）。在酿酒酵母中通过巯基氧化还原代谢工程改进氧化型谷胱甘肽发酵。 Appl Microbiol Biotechnol 99（22）：9771-9778。
Hara，K.Y.，Kiriyama，K.，Inagaki，A.，Nakayama，H。和Kondo，A。（2012）。通过酿酒酵母硫酸盐同化途径的代谢工程改善谷胱甘肽的产生。 Appl Microbiol Biotechnol 94（5）：1313-1319。
Kiriyama，K.，Hara，K.Y.和Kondo，A。（2013）。氧化型谷胱甘肽发酵使用工程化谷胱甘肽代谢的酿酒酵母。 Appl Microbiol Biotechnol 97（16）：7399-7404。
Kobayashi，J.，Sasaki，D.，Hara，K.Y.，Hasunuma，T.and Kondo，A。（2017）。酿酒酵母氧化谷胱甘肽发酵线粒体巯基氧化酶Erv1的酶学改良。 Microb Cell Fact 16（1）：44.