材料和试剂

注意：试剂来源对实验并不重要。

鼠骨髓来源的巨噬细胞（见下面的协议）
针对弓形虫的兔多克隆抗体（Fitzgerald Laboratories）
Alexa Fluor 488-缀合的山羊抗兔IgG（H + L）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A-11012）
Dulbecco氏改良氏培养基高葡萄糖（DMEM）（1x）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10313-039）
胎牛血清（FCS）（Hyclone，目录号：SH30396.03）; 热灭活56℃30分钟
L-岩藻胺（Hyclone，目录号：SH30034.01）
青霉素/链霉素（Hyclone，目录号：SV30010）
L929细胞（ATCC CCL1）条件培养基作为巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的来源，用于骨髓来源的巨噬细胞的成熟（参见下面的方案）
Dulbeccos PBS（Ca 2+和游离的Mg 2+）（DPBS）（Hyclone，目录号：SH30028.02）
弓形体寄生虫（tachyzoite），速殖子是弓形体的单倍体复制阶段，其可以在人成纤维细胞或其他宿主细胞类型中体外生长。
脂多糖（LPS）（来自大肠杆菌O55：B5＃203的List Biological）
重组鼠IFN-γ（Pepro Tech，目录号：50813665）
氨基胍（Thermo Fisher Scientific，Acros Organics，目录号：AC40078-1000） - 诱导型一氧化氮合酶抑制剂
硝普钠（SNP）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AC211640000） - 一氧化氮供体
16％无甲醇的多聚甲醛EM级（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
Triton X100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284-500）
安装介质如含有DAPI的Vectashield染色核（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
室玻片（22×50×1）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-548-5E）的盖玻片
4％多聚甲醛
KCl
KH ₂ PO ₄
NaCl
Na HPO ₄
DPBS（我们购买，但食谱在下面）（见配方）
D10媒体（见配方）
BMC媒体（见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）

设备

具有100x相或DIC物镜的荧光显微镜
能够容纳15或50 ml离心管的台式离心机
在37℃下加湿CO 2培养箱
细菌培养皿（100mm×15mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：0875712）
Zeiss逆转Axiovert 200
血细胞计数器
8孔室玻片（BD Biosciences，目录号：354118）或插入24孔板的孔中的盖玻片
无菌塑料50ml离心管（品牌不重要）

程序

分离鼠骨髓衍生的巨噬细胞（参见下面的方案）
在细菌培养皿上在BMC培养基中培养巨噬细胞1周（参见下面的配方和方案）
从具有冷DPBS（不含钙和镁）的细菌培养皿中取出巨噬细胞。这通过用冷DPBS冲洗，弃去添加的DPBS，重复洗涤，然后将板用PBS在4℃保持20分钟，并通过使用无菌转移移液管或血清移液管用DPBS洗涤单层来收集贴壁细胞来进行详细协议如下）。
在添加寄生虫以允许巨噬细胞粘附之前，将在250-300μlD10培养基中的浓度为3×10 5个巨噬细胞/ml的巨噬细胞加入室至少2小时。将盖放回室载玻片上，并置于37℃，5％CO 2的潮湿室中。向巨噬细胞中添加1 x 10 ⁴ 弓形虫寄生虫。寄生虫可以直接添加到已经在腔室中的250-300μl的培养基中。更换滑盖，并允许寄生虫在37℃的温度下在具有5％CO 2的湿润培养箱中侵入4小时。通常在每个室中加入在D10培养基中调节至适当浓度的1-10μl寄生虫。如果需要通过离心来调节寄生虫的浓度，然后在添加到室中之前在新鲜D10培养基中重悬，使用聚苯乙烯或PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）离心管作为寄生虫粘附到聚丙烯;离心1,700rpm [582rcf，10min]
取出介质，用新鲜的D10培养基冲洗腔玻片，以去除任何残留的细胞外寄生虫。在没有刺激的情况下，向室中加入250-300μl新鲜的D10培养基，替换盖并在37℃下在湿润的5％CO 2培养箱中孵育。不要让室玻片中的细胞在方案中的任何点变干，因为它会杀死寄生虫和宿主细胞。
如果适用，通过在新鲜D10培养基（250-300μl/室）中稀释刺激剂或抑制剂来活化细胞。
1. 为了激活巨噬细胞，加入LPS（10ng/ml）和/或重组鼠IFN-γ（100U/ml）。
2. 为了在激活巨噬细胞时抑制iNOS，加入LPS（10ng/ml），重组鼠IFN-γ（100U/ml）和氨基胍（1mM）。
3. 用NO-供体硝普钠（SNP）攻击加入100μMSNP
4. 巨噬细胞也可以在寄生虫侵入之前相对于寄生虫侵入后预活化24小时，虽然对寄生虫复制的影响可能不同，因为寄生虫侵入后激活的巨噬细胞通常更容许寄生虫生长。
在37℃和5％CO 2的潮湿培养箱中孵育24小时。如果需要确定寄生虫增殖或倍增时间的速率，可以进行动力学，而不是单个终点，即寄生虫攻击后6,12,24和36小时。
在所需温育后;倾倒培养基并用4％多聚甲醛（用1×PBS稀释至4％）在4℃下每孔用250μl固定巨噬细胞单层20分钟。
用1x DPBS冲洗两次。删除DPBS。在染色过程中不要让室干燥。
加入100微升含Triton X-100洗涤剂（参见配方）的封闭缓冲液30分钟，以阻断和透化宿主细胞和寄生虫，以便它们可以被抗体到达。
在等待时，将未标记的一级抗体在封闭缓冲液中稀释至适当的浓度：
1. 兔多克隆抗体对弓形虫 - 1：1,000稀释。然而，抗体的浓度需要由用户优化。针对弓形虫的其他抗体或直接偶联的荧光抗体可以被替代。
倒掉封闭溶液，向每个孔中加入100μl一抗稀释液。让1小时。
在等待时，将荧光标记的第二抗体在封闭缓冲液中稀释至适当的浓度：
1. Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H + L）-1:250稀释。抗体的最佳浓度可能需要由用户优化。
倒出一抗，并用洗涤缓冲液（参见Recipes）将每个孔漂洗3次，每次洗涤2分钟。通过将溶液倾倒在载玻片上并加入每个室250-300μl的洗涤缓冲液并使溶液静置约2分钟进行洗涤。
向每个孔中加入100μl次级抗体稀释液，放置1小时
倒出第二抗体并用洗涤缓冲液冲洗每个孔四次，每次洗涤2分钟
用1x DPBS洗涤每个孔两次，每次洗涤2分钟
使用包含DAPI或其他安装介质的Vectashield安装幻灯片。
使用具有100x相位或微分干涉对比（DIC）目标的荧光显微镜观察和分析巨噬细胞中的寄生虫。寄生虫的内部超微结构更好与相显微镜，但DIC提供了更多的三维透视。我们使用具有100倍物镜的Zeiss倒置Axiovert 200电动显微镜，Zeiss滤光片组31,34,38和50以及Axiovision 4.3软件。
为了检查寄生虫的复制率，可以进行时间过程分析。为了检查复制，应该计数每个PV的寄生虫数量。为了检查寄生虫是否通过激活而被杀死，与之后的时间点相比，在1小时时每个巨噬细胞的寄生虫数目也应该被检查。如果每个巨噬细胞的寄生虫数量随着时间的推移显着降低，则发生寄生虫细胞死亡。载玻片还可以使用与用于检测寄生虫的抗体和荧光染料不同的物种与溶酶体相关的膜蛋白-1共染色，以评价吞噬体 - 溶酶体融合的程度（Mordue和Sibley，1997）。
每个实验检查至少100个含寄生虫的液泡，并计算每个液泡的寄生虫数量。我们建议计数两组50个液泡或100个液泡以获得平均加或减标准偏差。注意寄生虫的形态，因为一些激活刺激可能导致寄生虫死亡和退化或无定形寄生虫空泡。

图1.在用IFN-γ和LPS激活的原始骨髓来源的巨噬细胞中的原始弓形虫复制。寄生虫显示为绿色，巨噬细胞核为蓝色到Vectashield封装介质中的DAPI。初始巨噬细胞中液泡中的寄生虫具有大于8个寄生虫/液泡，而在感染的巨噬细胞活化后的寄生虫每个液泡只有两个寄生虫。其他代表性图片如参考文献1-3所示

食谱

DPBS（我们购买，但食谱在下面）
2.7 mM KCl
1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v 136.9mM NaCl 8.9mM Na 2 HPO 4（7H 2 O）。
D10媒体
500 ml DMEM
50ml热灭活的FCS（10％终浓度） 5ml L-谷氨酰胺（终浓度2mM） 5 ml青霉素（100 U/ml 链霉素（100μg/ml终浓度）
BMC媒体
D10媒体（上述食谱）
20％L-929细胞条件培养基
阻塞缓冲区
45 ml 1x DPBS
5ml 10％胎牛血清 100μlTriton X100（0.2％Triton X-100）
洗涤缓冲液
49.5 ml 1x DPBS
0.5ml 10％胎牛血清（最终1％FCS）

L929条件培养基的方案（使用无菌技术）

在含有50ml D10培养基的150-cm 2组织培养瓶中平板接种5×10 5个L929细胞。
在37℃下在具有5％CO 2的湿润培养箱中培养细胞至融合，并收集上清液，因为L929细胞开始圆形化并从烧瓶中释放。 M-CSF由L929细胞在细胞死亡之前产生）
收集上清液，并以1,500rpm（453×g）离心（10分钟，沉淀上清液中剩余的任何L929细胞。）
使用前在50 ml离心管中冷冻40 ml等分试样（上清液在冷冻箱中扩增，这样离心管在冷冻前不应过满）。

骨髓分离和骨髓巨噬细胞分化方案（使用无菌技术）

通过CO 2吸入杀死小鼠。
用70％乙醇消毒腹部和后腿。
在腹部的中线做一个切口，小心不要穿透腹膜。拉回腹膜上方的皮肤以完全暴露后腿（股骨和胫骨）。
使用无菌小型解剖剪刀和镊子清洁所有肌肉组织的股骨和胫骨。通过在髋关节和膝关节和膝关节和踝关节切割，将股骨和胫骨与小鼠分开，并置于含有10ml无菌DPBS的无菌培养皿中。如果需要，骨骼可以在这一点进一步清除肌肉组织
切割在股骨和胫骨两侧的末端，足以暴露骨髓。
使用25号针头用10ml DPBS填充10ml注射器。将针头插入股骨或胫骨的一端，同时用镊子牢牢固定骨头，并将骨髓冲入50 ml离心管中。
吸取骨髓细胞上下分散成单细胞悬液
用血细胞计数器计数细胞，并在BMC培养基中将浓度调节至2×10 6个细胞/ml。
板10毫升细胞在每个无菌细菌培养皿。细菌培养皿的品牌是重要的，因为巨噬细胞粘着得太紧，以致于不容易在某些品牌和组织培养处理的塑料上移除。
将细胞在具有5％CO 2的潮湿培养箱中在37℃下孵育1周。在第5天，向已经在培养皿中的培养基中再加入10ml BMC培养基。这是为了提供新鲜的M-CSF，但留下已经由培养皿中的巨噬细胞产生的任何巨噬细胞衍生的生长因子
对于巨噬细胞去除，去除上清液，并用不含钙和镁的DPBS冲洗培养皿中的巨噬细胞两次。加入5ml无钙和镁的DPBS，将细胞置于4℃或冰箱中15-20分钟。使用无菌转移移液管或血清移液管将巨噬细胞从培养皿上取下（将培养板倾斜并冲洗在培养板底部）。从培养皿底部清除细胞时，巨噬细胞成功移位。
吸移含巨噬细胞的上清液在50ml离心管中，并在1,500 rpm（453 rcf）离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于10ml D10培养基中。使用血细胞计数器计数细胞并调节至3×10 5个细胞/ml的浓度。向8孔腔室载玻片的每个室中加入250-300μl。更换与腔室玻片一起的盖子，并在37℃下，在具有5％CO 2的潮湿培养箱中孵育细胞过夜，以使细胞粘附（如果细胞需要在同一天使用，则两小时就足够了）。

致谢

这项工作改编自我们用于在Skariah等人（2012）中公开的研究的方案。研究资金由D.G.来自国家健康研究所（NIH）1R01 AI 072028的Mordue。

参考文献

Mordue，D.G。和Sibley，L.D。（1997）。在形成时确定包含弓形虫的液泡的胞内命运，并取决于进入的机制。
Pollard，A.M.，Skariah，S.，Mordue，D.G.and Knoll，L.J。（2009）。 A 来自弓形虫的含有跨膜结构域的表面蛋白增强活化免疫细胞中的复制和建立慢性感染。 Infect Immun 77（9）：3731-3739。
Skariah，S.，Bednarczyk，R.B.，McIntyre，M.K.，Taylor，G.A.and Mordue，D.G。（2012）。发现对寄生虫对反应性氮中间体有抗性的重要的新型弓形体锥体相关蛋白。 a> J Immunol 188（7）：3404-3415