材料和试剂

标准培养皿（Labbox，目录号：PDIP-09N-500）
无菌10毫升聚苯乙烯培养管（Deltalab，目录号：300903）
OD 600读数的比色皿（Deltalab，目录号：303103）
1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
具有Nunclon Delta表面的12孔微量滴定板（Thermo Fisher Scientific，Nunc，目录号：150628）
无菌塑料环（1μl）（VWR，目录号：612-9351）
MicroAmp快速光学96孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，产品目录号：4346906）
MicroAmp®光学粘合剂薄膜（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，产品目录号：4311971）
在-80°C储存在甘油中的 Staphylococcus aureus （例如，来自我们实验室收集的金黄色葡萄球菌IPLA1）的冷冻库存
如前所述（Gutiérrez等人，2014）纯化，在-80℃（〜350μg/ ml =5.8μM）中用30％甘油储存在NaPi缓冲液中的经过滤的LysH5细胞内溶素储备液。
琼脂糖电泳（Conda，目录号：8008）
酸洗玻璃珠（≤106μm，无菌）（Sigma-Aldrich，目录号：G4649）
RNA保护细菌试剂（QIAGEN，目录号：76560）
Illustra TM RNAspin Mini Kit（GE Healthcare，目录号：25050071）
氯仿（Merck，目录号：1024451000）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP28184）
SUPERase-In TM RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM2694）
不含Turbo DNA的试剂盒TM（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM1907）
DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632-5G）
苯酚，分子生物学级（Merck，Calbiochem，目录号：516724-100GM）
用于RT-qPCR的iScript TM逆转录超混合物（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708841）
Power SYBR Green Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4367659）
细菌琼脂（ROKO S.A.）
D（+） - 葡萄糖（Merck，目录号：1.08337.1000）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：1.06404.1000）
氯化钾（KCl）（VWR，BDH，目录号：437025H）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（VWR，AnalaR NORMAPUR，目录号：102495D）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Merck，目录号：1048731000）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）（ITW Reagents Division，AppliChem，目录号：131965.1211） >
UltraPure TM Tris缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：15504020）
冰醋酸（Merck，目录号：1.00063.2500）
0.5M EDTA（pH8.0）（Alfa Aesar，USB，目录号：J15701）
TSB培养基（胰蛋白酶大豆肉汤，Scharlab，目录号：02-200-500）（见食谱）
TSA琼脂平板（见食谱）
补充葡萄糖的TSB培养基（TSBG）（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（见食谱）
磷酸钠（NaPi）缓冲液（见食谱）
Tris-acetate-EDTA（TAE）缓冲液（见食谱）

设备

移液器（体积范围：1μl-10μl，2μl-20μl，20μl-200μl，200μl-1,000μl）
在25°C和37°C摇动（250 rpm）和静态培养箱
分光光度计
注：它用于测量细胞培养的光密度（OD 600 ）。
Epoch微孔板分光光度计（BioTek Instruments，型号：Epoch）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
FastPrep®/ -24（MP Biomedicals，产品目录号：116004500）
凝胶电泳装置（Bio-Rad Laboratories，Mini-Sub Cell GT Cell）
涡流
7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，产品目录号：4351107）
Illumina HiSeq2000平台
计算机配备四个Intel Xeon E5-4650 v2 2.4GHz 25M 8GT / s 10核处理器，256 GB RAM，并运行CentOS Linux 7.3.1611版本。
注：计算机用于执行计算。

软件

FastQC（ http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects /download.html#fastqc ）
BowTie2（ http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）（Langmead和Salzberg，2012）
EDGE-Pro（ http://ccb.jhu.edu/software/EDGE-pro/）（Magoc et al。，2013）
DEseq2（ http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2 .html ）（Love et。，2014）

程序

生物膜的形成和处理（图1）
1. Streak out S。将来自冷冻原料的金黄色葡萄球菌菌株（IPLA1）置于TSB琼脂平板上，并在37℃静置培养过夜。
2. 为了获得三个生物学复制品，挑选3个分离的菌落。用无菌塑料环从琼脂平板上接种金黄色葡萄球菌，接种到含有2毫升TSB培养基的三个10毫升聚苯乙烯管中。
3. 在37°C过夜培养细菌培养物，摇动速度为250 rpm。
4. 在含有约10 7 CFU / ml的TSBG培养基（补充有葡萄糖的TSB）中将过夜培养物稀释至OD 600的0.1，然后进行1:20稀释在相同的培养基中制备用于生物膜测定的接种物。
5. 在12孔微量滴定板的每个孔中接种2ml（约5×10 5 CFU / ml）（每个生物学复制品4个孔）。
6. 在25℃静置微量滴定板24h。
  注：在这种情况下，用于生物膜形成和处理的温度为25℃，这代表“室温”下的处理/消毒。尽管如此，该实验也可以在不同的温度下进行;例如，在37°C下代表人类感染的治疗。
7. 除去孔中的浮游生物相，每次用2 ml PBS洗生物膜两次
8. 对于每个重复，将1ml NaPi缓冲液单独添加到两个孔中，并向另外两个孔中添加1ml含有10.94μg/ ml（0.18μM）LysH5的NaPi。
9. 在25°C静态孵育30分钟
10. 去除上清液。
11. 用PBS洗两次。
12. 在1ml RNA中收获对应于相同生物学重复和处理的细胞，通过用移液枪尖端刮取500μlPBS并转移到干净的Eppendorf管中。
13. 根据RNA保护®制造商的说明处理样品。
14. 储存在-80°C或进行RNA纯化。
  
  图1.该方案的示意图。该方法的不同步骤包括生物膜形成和处理（紫色），随后的RNA纯化和RNA测序（粉红色）以及最后生成的计算机分析数据（浅绿色）。
RNA纯化和测序（图1）
1. 为了实现细胞裂解，使用FastPrep设备对玻璃珠和酚进行机械破碎。
2. 裂解后，将样品在4℃以9,000×g离心10分钟。
3. 将上层相转移到干净的试管中并加入500μl氯仿，然后在9,000gxg和4℃下离心5分钟。
4. 将上层相转移到干净的管中，并通过移液将其与250μl乙醇混合。
5. 将混有乙醇的样品转移到illustra™RNAspin Mini试剂盒提供的色谱柱中，按照制造商提供的说明执行RNA纯化步骤的其余部分。
6. 用50μl不含核酸酶的水洗脱并加入1μlSUPERase-In TM 。
7. 每50μl样品加5μlTurbo DNase缓冲液和1μlTurbo DNase，37℃孵育30分钟。
8. 每个样品加1μlTurbo DNase，37℃孵育30分钟。
9. 按照制造商的说明使用灭活剂从样本中去除DNA酶
10. 每50μl样品加1μlSUPERase抑制剂
11. 在TAE缓冲液和Epoch微孔板分光光度计（图2）中通过琼脂糖凝胶电泳（1％琼脂糖）检查RNA质量和浓度。使用该方案获得的RNA浓度通常介于200和700 ng /μl之间。
  
  图2.来自 S的总RNA的琼脂糖凝胶电泳。生物膜样品不同RNA样品的等分试样（1-2μl）在1％琼脂糖凝胶中运行。对应于23S和16S rRNA的两个条带应该是可见的并且优选地以2：1（23S：16S）的比例指示RNA完整性。有时也可以观察到对应于5S rRNA的较低带。
12. 具有A 260 / A 280比率≥1.8的样品可被认为足以用于RNA-seq分析。否则，请按照制造商推荐的方案使用illustra™RNAspin Mini试剂盒清洁样品。
13. 从每个样品取8μgRNA，按照所选平台制造商推荐的方案进行测序步骤。例如，在本研究中，根据Illumina推荐的方案，将样品送至外部服务提供商（Macrogen Inc.，South Korea），用Illumina HiSeq2000平台进行测序，产生100-bp配对末端读数。
计算机分析生成的数据（图1）
1. 使用FastQC检查FASTQ格式的读取质量。
2. 从NCBI档案库（ ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/archive/old_genbank/Bacteria/ ）。
3. 运行带有参数的脚本“edge.pl”，该参数指示包含每个样本（-u和-v）以及上述三个文件（-g，-p和-r）的配对结尾读取的FASTQ文件以及输出文件名称（-o）。在第一步中，EDGE-Pro将使用BowTie2程序将读数映射到参考基因组，并创建一个比对文件作为输出（该文件将以序列比对图或SAM格式）。 BowTie2也显示与参照基因组的比对百分比。完成此步骤后，EDGE-Pro将转录本定量转换为每百万次映射读取（RPKM）转录本的读数。包含RPKM计数的输出文件将以“.rpkm_0”结尾。
  示例：
  /edge.pl -g SAreference.fna -p SAreference.ptt -r SAreference.rnt -u Lys_1-1.fastq -o Lys1 -v Lys_1-2.fastq
4. 运行指示要分析的.rpkm_0文件的脚本“edgeToDeseq.perl”，以生成收集每个基因和每个样本的原始计数的表格。该表格将保存在输出“deseqFile”中。
  示例：
  /edgeToDeseq.perl NaPi1.rpkm_0 NaPi2.rpkm_0 NaPi3.rpkm_0 Lys1.rpkm_0 Lys2.rpkm_0 Lys3.rpkm_0
  注意：这一步是必需的，因为DESeq2需要关于原始计数而不是RPKM的信息。
5. 使用上一步中的“deseqFile”作为输入，使用DESeq2对已处理和未处理样本进行差异表达分析。选择具有调整的 P 值的基因 0.05进行进一步分析并保存.csv格式的差异表达基因表。
通过RT-qPCR确认RNA-seq结果（图1）
1. 如制造商所示，将来自每个样品的0.5μgRNA转化成具有用于RT-qPCR的iScript TM逆转录超混合物的cDNA。
2. 在无核酸酶的水中稀释cDNA样品1:25，并将它们用作qPCR的模板。
3. 为了进行qPCR，将来自不同样品的2.5μl等分试样与3.25μl不含核酸酶的水一起加入到MicroAmp Fast Fiber 96孔反应板的每个孔中，将0.25μl来自10μM储备液和6.25μlPowerSYBR®Green Green Master Mix。
4. 分析每个生物学重复
5. 根据2-ΔΔCT方法（Livak和Schmittgen，2001），通过使用参考基因（在这种情况下为rplD）确定基因表达的变化，其中ΔCT= CT （目标基因）-CT（参考基因）和ΔΔCT=ΔCT（目标样品）-ΔCT（参考样品）。

数据分析

为了重现性，建议分析三个独立的生物学重复（BR）。 RNAseq数据的统计分析是用DESeq2软件包作为差异基因表达分析的一部分进行的，并且只有那些具有调整后的值的基因选择0.05作进一步分析。关于倍数变化，我们通常将截止值设定为2倍变化（log <2> fold-change = 1）。然而，在这种情况下，进一步分析所有基于调整的P 值显示显着变化的基因。这些小的变化可能是由于只有部分生物膜群体暴露于抗微生物剂的事实。除了在此处描述的条件下确认基因之外，在暴露于细胞内溶素LysH5的液体培养物中进一步评估了变化。该分析显示由RNA-seq鉴定的一些基因中的更明显的变化，其强化了观察到的生物膜中的转录变化确实是内溶素暴露的结果的观点。

食谱

胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）
30克TSB培养基
溶于1升ddH 2 O和高压灭菌器中
TSA琼脂平板
含2％琼脂的TSB培养基
溶于ddH 2 O和高压灭菌器
TSBG中等
含0.25％葡萄糖的TSB培养基
溶于ddH 2 O和高压灭菌器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液
137mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4 4/2 2mM KH 2 PO 4 4/2 调整pH值到7.4
溶于ddH 2 O和高压灭菌器
NaPi缓冲液
50 mM磷酸钠
调整pH值到7.4
溶于ddH 2 O和高压灭菌器
TAE缓冲液（50x储备液）
242克Tris

57.1毫升冰醋酸 100毫升0.5M EDTA（pH8.0）
将去离子水加入1升

致谢

该协议的制定由AGL2012-40194-C02-01（科学和创新部，西班牙），AGL2015-65673-R（科学，技术和创新计划2013-2017），Proyecto Intramural CSIC 201770E016，欧盟ANIWHA ERA-NET（BLAAT ID：67）和GRUPIN14-139（FEDER EU基金，西班牙Principado de Asturias）。 L.F.被授予Marie Curie Clarin-Cofund博士后奖学金。 P.G。和A.R.是FWO Vlaanderen资助的噬菌体生物研究社区（WO.016.14）和噬菌体网络FAGOMA的成员。该协议改编自以前发表的文章Fernández et。（2017）。
作者声明他们没有利益冲突。

参考

Fernández，L.，González，S.，Campelo，A. B.，Martínez，B.，Rodríguez，A.和García，P.（2017年）。噬菌体衍生溶解蛋白下调自溶素编码基因抑制金黄色葡萄球菌中的生物膜形成 Antimicrob Agents Chemother 61（5）。
Gutiérrez，D.，Ruas-Madiedo，P.，Martínez，B.，Rodríguez，A.和García，P.（2014年）。通过内溶素LysH5有效去除葡萄球菌生物膜 PLoS一个9（9）：e107307。
Langmead，B。和Salzberg，S.L。（2012）。快速阅读与Bowtie 2对齐。 Nat Methods 9（4）：357-359。
Livak，K.J。和Schmittgen，T.D。（2001）。使用实时定量PCR分析相对基因表达数据和2 ^{-ΔΔCT方法。方法 25（4）：402-408。}
Love，M. I.，Huber，W.和Anders，S。（2014）。使用DESeq2对RNA-seq数据的倍数变化和扩散进行适度估计基因组生物学 15（12）：550。
Magoc，T.，Wood，D。和Salzberg，S.L。（2013）。 EDGE-pro：原核生物基因组中的基因表达的估计程度。 Evol Bioinform Online 9：127-136。