材料和试剂

移液器吸头（STARLAB，目录号：S1111-6700）
50 ml Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
1.5 ml Eppendorf管（Eppendorf，产品目录号：0030120086）
0.2ml PCR管（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0620）
0.45μm纤维素过滤器（Carl Roth，目录号：KH55.1）
Ni-NTA柱（GE Healthcare，目录号：17524801）
50毫升注射器（VWR，目录号：53548-010）
制造商：Air-Tite Products，产品目录号：4850001000。
20 x 20 mm玻璃载玻片（VWR，目录号：631-0122）
注意：载玻片用作蛋白质功能化和细菌实验的玻璃表面。＆nbsp;
Parafilm（Sigma-Aldrich，Bemis，目录号：P76 68）
铝箔（卡尔罗斯，目录号：1770.1）
35毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1135.500）
透析管（Repligen，Spectrum，目录号：132592）
质粒pB33eCPX（Addgene质粒）（Addgene，目录号：23336）
GFP和mCherry pTrc99A质粒（Victor Sourjik实验室，Chen和Wegner，2017）
nMag高pET-21b（+）质粒（Genescript，Chen和Wegner，2017）
nMagHigh-eCPX质粒（国产，Chen和Wegner，2017）
注意：nMagHigh基因插入到pB33eCPX的KpnI和SacI切割位点之间。＆nbsp;
pMag-eCPX，pMagHigh-eCPX，pMagFast1-eCPX质粒（国产，Chen和Wegner，2017）
注意：使用QuikChange II定点诱变试剂盒通过nMagHigh-eCPX质粒的点突变产生不同的pMag变体。
电子。大肠杆菌K12 MG1655（DSMZ，目录号：18039）
BL21（DE3）胜任 E。（自制的，陈和Wegner，2017）
DH5α感受态E. （自制的，陈和Wegner，2017）
PBS片剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：18912014）
Mowiol（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
LB培养基（Carl Roth，目录号：X968.3）
氨苄西林（Carl Roth，目录号：HP62.2）
IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632-10G）
PEG-叠氮化物（自制）
三乙胺（Sigma-Aldrich，目录号：T0886）
无水甲苯（Alfa Aesar，目录号：41464-AK）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：798681）
NiCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：339350）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
L-阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
多聚甲醛，试剂级（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960）
NTA-炔（国产，Schenk等人，2014）
PEG叠氮化物（自制，Schenk等人，2014）
硫酸铜（CuSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：451657）
30％H 2 O 2（Carl Roth，目录号：8070.4）
H 2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：30743）
TEM（透射电子显微镜）网格（Ted Pella，目录号：1GC150）
离心管500ml和50ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：3141-0500,3119-0050）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：10224490）
N 2气（Westfalen）
乙酸乙酯（VWR，目录号：23882.321）
Picodent twinsil 22（Picodent，目录号：13001000）
缓冲区A（见食谱）
缓冲区B（见食谱）
点击反应解决方案（请参阅食谱）
Riranha解决方案（请参阅食谱）

设备

杜蒙＃7镊子（卡尔罗斯，目录号：K344.1）
注：Dumont＃7镊子用于拿起载玻片。
0.1-2.5μl，0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl移液器（Eppendorf，目录号：3123000012,31200000020,3123000047,3123000063）
涡旋（neoLab，目录号：7-0092）
微量离心机（VWR，型号：Micro Star 17，目录号：521-1646）
高速离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-26S）
用于高速离心机的转子（Beckman Coulter，型号：JA-10，JA-25.50）
孵化器（VWR，目录号：444-0732）
Sonicator（OMNI，型号：Sonic Ruptor 400）
倒置荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DMi8）
超声波清洗器（BANDELIN electronic，型号：Sonorex Super RK 31）
蓝色LED面板（Albrillo，型号：LL-GL003）
OD仪（Biochrom，BioWave，型号：WPA CO8000）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 8000）＆nbsp;

软件

ImageJ
Originlab
注意：Oringinlab用于数据分析。

程序

nMag高蛋白表达和纯化
1. 用pET-21b（+）表达质粒中的C端His6标签将nMagHigh转化到BL21（DE3）E中。使用标准方案培养大肠杆菌细胞。
2. 从含有50μg/ ml氨苄青霉素的10ml LB中的单个菌落中制备发酵剂培养物。在37℃以250转/分孵育过夜。
3. 将10ml过夜培养物转移至含有50μg/ ml氨苄青霉素的1L LB中并在37℃以200rpm生长至OD 600 = 0.6-0.8。当达到所需的OD 600时，向培养物中加入500μlIPTG（1M储备液，500μM终浓度）并在16℃以250rpm孵育过夜。
4. 使用具有JA-10转子的高速离心机（500ml离心管）在4℃下6,371×gg的球团细菌8分钟。丢弃上清液。以下所有步骤都必须在冰上完成。
5. 在含有补充1mM PMSF（100mM储液的甲醇溶液）和1mM DTT（1M水溶液）的20ml缓冲液A（配方1）中重悬沉淀。将悬浮液转移到50毫升Falcon管中。
6. 通过超声波溶解细菌。 tip sonicator的设置：50％频率，40％功率，10分钟。超声处理过程中保持猎鹰冰。将溶胞产物转移到塑料高速离心管中，使用JA-25.50转子（50ml离心管），在17,418×g，4℃下离心30分钟。
7. 通过0.45μm纤维素过滤器过滤两次上清液。
8. 用20-30ml缓冲液A + 1mM DTT平衡Ni-NTA柱（柱体积= 5ml）。
9. 通过使用50ml注射器使裂解物两次滴加将澄清的细胞裂解物加载到Ni-NTA柱上。
10. 用10ml缓冲液A + 1mM DTT和50ml（47.5ml缓冲液A + 2.5ml缓冲液B + 1mM DTT）洗涤Ni-NTA柱（配方2）。
11. 用10ml缓冲液B + 1mM DTT洗脱。丢弃前3毫升，收集最后7毫升含有蛋白质。
12. 用缓冲液B（50毫升，不含DTT）再用缓冲液A（50毫升，不含DTT）再次清洗柱子。将Ni-NTA色谱柱存放在冰箱中。
13. 将蛋白质溶液放入透析袋（截留分子量= 3,500Da）中，并在2L缓冲液A中在4℃搅拌3小时进行透析。用新鲜的缓冲液A替换并在4°C透析另外3小时。收集蛋白质溶液并储存在-80°C。通过Nanodrop测量蛋白质浓度。
用nMagHigh功能化玻璃表面
1. 标记载玻片的右上角（20 x 20 mm）以区分上侧。在新鲜配制的食人鱼溶液中清洁玻璃表面1小时，用Milli-Q水冲洗三次并在N 2流中干燥。
2. 对于PEG化反应，将表面浸入PEG-叠氮化物（10mg PEG-叠氮化物，MW = 3,500g / mol）和一滴三乙胺在50ml无水甲苯中的溶液中并在N 下保持在79℃过夜在密闭的容器中> 2个大气。请注意，表面不应该相互接触。
3. 首先用乙酸乙酯通过声处理（超声波频率：35kHz）清洗表面5分钟，然后通过超声处理用甲醇清洗5分钟并在N 2 / N 2流中干燥。
4. 准备潮湿的室进行点击反应，将湿纸巾放在培养皿的盖子上，并用封口膜的清洁面覆盖。
5. 准备点击反应解决方案（六个表面）（配方3）。
6. 在培养皿中的石蜡膜上放100μl点击反应溶液。
7. 将一个载玻片颠倒放置在每个点击反应溶液液滴上（标记的表面应与点击反应溶液接触）。在室温下孵育2小时。
8. 点击反应后，用1）缓冲液A中的50mM EDTA洗涤载玻片5分钟以除去Cu 2 +，2）缓冲液A两次5分钟。
9. 在室温下在封口膜上用100μl100mM的NiCl 2 2孵育载玻片5分钟。 Ni 2 +与表面上的NTA基团复合以结合His标签。用缓冲液A清洗载玻片两次以除去多余的Ni2 +。
10. 将100μlnMagHigh蛋白溶液（10μM，在缓冲液A中）滴在封口膜上并将玻璃载玻片倒置在液滴上。在室温下孵育30分钟。
  注：未与nMagHigh蛋白孵育的玻璃表面将在D中用作阴性对照。
11. 使用无菌PBS冲洗载玻片两次，并将它们保存在PBS中。
  注意：nMagHigh功能化载玻片应该为新的细菌实验做好准备。＆nbsp;
细菌准备
1. 共同转换 E。使用pMagHigh-eCPX或pMag-eCPX或pMagFast1-eCPX质粒（氯霉素抗性）和GFP pTrc99A质粒（氨苄青霉素抗性）在大肠杆菌K12 MG1655上进行筛选，并在具有35μg/ ml氯霉素和50μg/ ml氯霉素的LB-琼脂平板上进行选择μg/ ml氨苄青霉素。
2. 将单菌落接种到含有35μg/ ml氯霉素和50μg/ ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中并在37℃以250rpm孵育过夜。
  用铝箔包裹所有的管子
3. 将500μl过夜培养物添加到含有35μg/ ml氯霉素和50μg/ ml氨苄青霉素的新鲜20ml LB培养基中，并在37℃，250rpm下培养2小时。
  用铝箔包裹所有的管子
4. 当OD 600 = 0.5时，添加0.04％m / v L-阿拉伯糖以诱导pMag-eCPX蛋白和0.5mM IPTG的表达以诱导荧光蛋白的产生并将培养物在25℃，250rpm，4小时。
5. 将细菌在1,500×g下旋转10分钟并用PBS洗涤两次。最后，将PBS中的细菌重新悬浮至OD 600 = 1.0。
细菌粘附分析
1. 用上述方法使用nMagHigh蛋白质功能化玻璃表面，并将它们保存在黑暗中的PBS中。使用不与nMagHigh蛋白孵育的表面作为阴性对照以确保PEG的功能化起作用。
2. 将每个玻璃表面放在35毫米培养皿中。向每个培养皿中加入3ml在PBS中OD 600 = 1.0的细菌溶液（细菌表达pMagHigh或pMag或pMagFast1）。
3. 在室温下，在蓝光照明下（蓝色LED面板，640μW/ cm 2），将一组表面与细菌放置1小时。将第二组表面放置在黑暗中1小时。
4. 用PBS轻轻洗涤表面三次。用4％多聚甲醛固定细菌20分钟，并将它们装入Mowiol。通过20倍物镜在倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上的每个表面上获取GFP通道中的9个荧光图像。（图2）
5. 使用ImageJ中的粒子分析器工具分析表面上的细菌数量。
图2.荧光图像 E。在蓝光下但不在黑暗中显示粘附在nMagHigh官能化底物上的pMagHigh。细菌用GFP标记以用于检测。经Chen和Wegner（2017）许可转载。
细菌附着动力学
1. 用上述方法使nMagHigh蛋白质功能化五个玻璃表面。
2. 将每个玻璃表面放在35毫米培养皿中。向每个培养皿中加入3ml pMagHigh-eCPX细菌的PBS（OD 600 = 1.0）。
3. 在室温下在蓝光照明下（蓝色LED面板，640μW/ cm 2 2 ）孵育不同时间的表面（10,30,60,120到180分钟）。
4. 用PBS轻轻洗涤每个表面三次。用4％多聚甲醛固定细菌并将它们装入Mowiol。通过倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上的每个表面获得GFP通道中的9个荧光图像（E <=> = 488nm，Emin = 510nm） 20倍的目标。
5. 使用ImageJ中的粒子分析器工具分析表面上的细菌数量。
6. 使用相应的细菌，按照从E1到E5的步骤，以相同的方式量化pMag-eCPX和pMagFast1-eCPX细菌的附着动力学。
通过蓝光照明强度调节细菌附着
1. 使用如上所述制备的用nMagHigh蛋白质功能化的六个玻璃表面。
2. 将每个玻璃表面放在35毫米培养皿中。向每个培养皿中加入3ml pMagHigh-eCPX细菌的PBS（OD 600 = 1.0）。
3. 在室温下用不同强度（0,3.2,32,320,640或3,200μW/ cm 2 ）在蓝光照明下孵育表面1小时。
4. 用PBS轻轻洗涤表面三次。用4％多聚甲醛固定细菌并将它们装入Mowiol。通过20倍物镜在倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上获取每个表面的GFP通道中的9个荧光图像。使用ImageJ中的粒子分析器工具分析表面上的细菌数量。
细菌脱离动力学
1. 使用由上述方法制备的nMagHigh蛋白质功能化的六个玻璃表面。
2. 将每个玻璃表面放在35毫米培养皿中。向每个培养皿中加入3ml pMagHigh-eCPX细菌的PBS（OD 600 = 1.0），并在蓝色光照下（蓝色LED板，640μW/ cm 2））在室温下1小时。
3. 。将培养皿分别移至0,10,30,60,120或240分钟
4. 用PBS轻轻洗涤每个表面三次。用4％多聚甲醛固定细菌并将它们装入Mowiol。通过20倍物镜在倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上获取每个表面的GFP通道中的9个荧光图像。使用ImageJ中的粒子分析器工具分析表面上的细菌数量。
多次附着和分离周期
1. 使用由上述方法制备的nMagHigh蛋白质功能化的五个玻璃表面。
2. 将每个玻璃表面放在35毫米培养皿中。向每个培养皿中加入3ml pMagHigh-eCPX细菌的PBS（OD 600 = 1.0），并在蓝色光照下（蓝色LED板，640μW/ cm 2））在室温下连接1小时。
3. 用PBS轻轻洗涤第一个表面三次。用4％多聚甲醛固定细菌并将它们装入Mowiol。采集如上所述的图像。
4. 同时，将其他四个表面在黑暗中保持2小时以进行细菌分离。
5. 用PBS轻轻洗涤第二个表面三次，然后用4％多聚甲醛固定细菌。
6. 同时，将其余三个表面置于蓝色光下（蓝色LED面板，640μW/ cm 2 ）1小时以进行连接。
7. 重复步骤H3到H6进行另一个循环。对于每个表面，通过20倍物镜在倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上获取GFP通道中的9个荧光图像。使用ImageJ中的粒子分析器工具分析表面上的细菌数量。
细菌图案
1. 共同转换 E。使用pMagHigh-eCPX（氯霉素抗性）和mCherry pTrc99A质粒（氨苄青霉素抗性）质粒转化大肠杆菌K12 MG1655。如上所述准备细菌。
2. 将具有nMagHigh蛋白质固定的玻璃表面粘贴到35mm培养皿的底部（具有15mm直径的圆孔）。将OD 600 = 1.0的3ml pMagHigh-eCPX细菌溶液加入培养皿并保持在黑暗中。
  注意：Picodent twinsil 22可以用来粘贴玻璃表面到培养皿底部。
3. 通过10倍物镜在倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）上通过光掩模（没有支撑膜的TEM网格）在玻璃表面局部照射1小时。
4. 去除光掩模，并通过去除2ml溶液并将2ml PBS加入培养皿中轻轻洗涤玻璃表面。重复洗涤三次。不要让表面变干。
5. 通过倒置荧光显微镜（DMi8，Leica）通过10倍物镜对该表面进行成像。（图3）
  
  图3. pMagHigh显示细菌到nMag的光图案化高功能化玻璃表面。A）明场和B）细菌图案的荧光图像。用mCherry标记细菌进行检测。经Chen和Wegner（2017）许可转载。

数据分析

数据信息可以通过 https://pubs.acs.org/doi/abs /10.1021/acssynbio.7b00197 。

笔记

所有的实验都在黑暗的房间里进行。＆nbsp;
在黑暗中培养细菌以避免激活光敏蛋白质。

食谱

缓冲区A（1x）
50mM Tris-HCl，pH7.4
300mM NaCl（1L缓冲液17.5g）
缓冲区B（1x）
缓冲区A
250mM咪唑（1g缓冲液17g）
点击反应解决方案（六个表面）
473μlMilliQ水
pH 8.5的60μl1M Tris-HCl
60μl1M L-抗坏血酸（新制备：741μlMilliQ水中的102mg L-抗坏血酸）
0.9μl25mM NTA-炔烃
6μl100mM CuSO 4（最后加入;加入时，局部出现棕色，混合后溶液变成无色）。
通过涡流混合解决方案
Riranha解决方案
3：1（v / v）浓度。 H 2 O 4 SO 4：H 2 O 2（30％）
20毫升H 2 O 2（30％）
60毫升H 2 SO 4。

致谢

这项工作是由德国联邦教育和研究部（BMBF）和马克斯普朗克协会（FKZ 031A359L）联合资助的MaxSynBio联盟的一部分。足球俱乐部感谢中国国家留学基金委博士生奖学金。 GFP和mCherry质粒来自Victor Sourjik教授，CPX质粒来自Patrick Daugherty教授（Addgene质粒＃23336）。我们要感谢Stefan Schumacher对数字的帮助。该协议是从以前的工作改编（陈和Wegner，2017）。我们要感谢ACS Synthetic Biology的编辑允许重印这些数字。没有利益上的冲突。

参考

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