材料和试剂

SHARP ®精密阻隔技巧，适用于P-1000和Eppendorf1,000,1,250μl（Denville Scientific，目录号：P1126）
SHARP ®精密阻隔技巧，适用于P-200,200μl（Denville Scientific，目录号：P1122）
SHARP ®精密阻隔技巧，适用于P-20,20μl（Denville Scientific，目录号：P1121）
SHARP ®精密阻隔技巧，P-2和P-10超长，10μl（Denville Scientific，目录号：P1096-FR）
Gold Seal TM Rite-On TM Micro Slides（Thermo Fisher Scientific，目录号：3050-002）
12毫米显微镜盖玻片-1.5（Fisher Scientific，目录号：12-545-81）
TPP ®离心管，容量50 ml，聚丙烯（TPP Techno Plastic Products，目录号：91050）
TPP ®离心管，容量15 ml，聚丙烯（TPP Techno Plastic Products，目录号：91015）
Stericup TM 无菌真空过滤装置500 ml（默克，产品目录号：SCGPU05RE）
24孔板（Corning，Falcon ®，目录号：353226）＆nbsp;
6孔板Nunclon TM Delta Surface（赛默飞世尔科技，目录号：140675）
专业Kimtech Science TM Kimwipes TM （KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
优质微量离心管：1.5 ml（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
NIH3T3（ATCC，目录号：CRL-1658）
超纯水
DMEM（1x）4.5g / L D-葡萄糖，[ - ] L-谷氨酰胺，[ - ] HEPES，[ - ]丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11960044）< br />
Opti-MEM TM 还原血清培养基（赛默飞世尔科技，目录号：31985070）
笔/ Strep，100x（默克，目录号：TMS-AB2-C）
HyClone TM Cosmic Calf TM 血清（BCS）（GE Healthcare，目录号：SH30087.03）
MEM NEAA（100x）MEM非必需氨基酸（赛默飞世尔科技，Gibco TM ，目录号：11140050）
L-谷氨酰胺（100x）（100 ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：25030081）
丙酮酸钠（100 mM）100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11360070）
Lipofectamine ® 3000转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：L3000-015）
70％（体积）乙醇在水中稀释
0.05％胰蛋白酶0.53 nM EDTA，1x [ - ]碳酸氢钠（Corning，目录号：25-052-Cl）
DPBS，1x（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）（Corning，Cellgro TM ，目录号：21-031-CM）
磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
磷酸二氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5011）
硼氢化钠（Sigma-Aldrich，目录号：213462-25G）
甲醛，16％，不含甲醇，超纯EM等级（Polysciences，目录号：18814-10）
戊二醛，8％水溶液，EM级（电子显微镜科学，目录号：16019）
普通山羊血清（10 ml）（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
Tween 20（Acros Organics，目录号：AC233360010）＆nbsp;
Sonic hedgehog（Shh）抗体（H-160），兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-9024）
Alexa Fluor TM 633鬼笔环肽（赛默飞世尔科技，目录号：A22284）
山羊抗兔IgG（H + L）二抗，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：R37116）
DAPI溶液（1mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）
延长®金刚石抗褪色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：P36961）
NIH3T3培养基（见食谱）
NIH3T3血清/无抗生素培养基（见食谱）
0.2 M二元磷酸钠溶液（见食谱）
0.2 M一元磷酸钠溶液（见食谱）
改良电子显微镜固定剂（MEM-fix）（见食谱）
透化缓冲液（见食谱）
PBGT（见食谱）
一抗溶液（见食谱）
二抗溶液（见食谱）

设备

Eppendorf Research Plus单通道移液器，100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3123000063）
Eppendorf Research Plus单通道移液器，20-200μl（Eppendorf，目录号：3123000055）
Eppendorf Research Plus单通道移液器，0.5-10μl（Eppendorf，目录号：3123000020）
Eppendorf Research Plus单通道移液器，0.1-2.5μl（Eppendorf，目录号：3123000012）
Allegra X-12R离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra ® X-12R，目录号：392302）
Heracell VIOS 160i CO 2 培养箱（37°C和5％CO 2 ），（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM VIOS 160i ，产品目录号：51030287）
AE50分析天平（Mettler-Toledo International，型号：AE50）
吸气器
精密双室水浴288（赛默飞世尔科技，目录号：2853）＆nbsp;
生物安全柜（The Baker Company，目录号：B40-112）＆nbsp;
细胞计数室（Hausser Scientific，目录号：3200）
Fisherbrand TM Fine Point高精度镊子（Fisher Scientific，目录号：22-327379）
共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP8）

软件

Leica Application Suite X（用于生成Tiff）

程序

第1天：播种细胞（见注1）
将0.5×10 6个 6 NIH3T3细胞接种到6孔细胞培养皿的每孔1.5ml培养基中。每个实验条件使用一个孔。如果不进行转染，请从步骤C1开始。
注意：所有处理细胞的步骤都应在生物安全柜内进行，直到准备开始免疫细胞化学。
第2天：转染（见注2）
1. 在转染之前，贴壁细胞应处于50-80％的汇合处。取出培养基，换上1 ml预热（37°C）血清和无抗生素的生长培养基，以最大限度地提高转染效率。
2. 根据转染试剂方案（我们使用含有P3000的Lipofectamine 3000），用总共2μg编码目的蛋白的质粒DNA转染每个孔。
3. 转染后6小时吸出转染孔的培养基，并用1.5ml完全培养基替换。
第3天：重新播种细胞（见注3）
1. 在生物安全柜中，清洁12毫米的盖子在70％乙醇中滑动。将干净的盖玻片放入24孔细胞培养板的各个孔中。在重新接种细胞之前，将紫外线照射到开口24孔板中的盖玻片上15分钟进行灭菌（见注4）。
2. 从6孔板孔中吸出培养基，用预热（37℃）DPBS洗涤NIH3T3细胞。从井中吸取DPBS。
3. 每孔加入500μl预热的37°C胰蛋白酶，置于培养箱中3-5分钟，直至细胞脱落。加入2 ml培养基中和胰蛋白酶，计数细胞室中的细胞。
4. 将细胞悬浮液转移到15 ml离心管中，在室温下以~200 x g 离心5分钟。
5. 当细胞在离心机中时，在24孔板的每个含盖玻片的孔中加入500μl培养基。
6. 吸出细胞上清液，将细胞沉淀重悬于5 ml预热培养基中。
7. 加入适量的细胞悬液，使每个带盖玻片的孔含有0.1×10 6 细胞。
8. 允许细胞完全附着到盖玻片上6-8小时并允许细胞色素再生，或者最佳等待过夜（> 10小时）以完全附着和生长（参见注释5）。
第4天：免疫细胞化学
至关重要：从现在开始，不要吸气。添加或移除任何溶液时轻轻移液。尝试尽可能少地移动板，在洗涤过程中不要搅拌板。这可能会破坏或破坏细胞质。在孵育和洗涤过程中，让溶液静置在细胞上。
1. 移取培养基并用室温DPBS快速洗涤细胞3次。
2. 取出DPBS并向细胞中加入400μlMEM-fix，然后在室温下孵育7分钟。
3. 移取MEM-fix并在室温下在DPBS中洗涤细胞三次，每次洗涤5分钟。
4. 在DPBS中洗涤细胞时，准备透化缓冲液。有关说明，请参阅食谱。
5. 去除最后一次DPBS清洗，每孔加入400μl透化缓冲液，室温孵育1小时。
6. 当细胞透化/阻断时，在PBGT中制备一抗稀释液。有关说明，请参阅食谱。
7. 去除透化缓冲液，并向每个孔中加入300μl一抗稀释液。将板在4°C孵育过夜。
第5天：二抗和盖玻片安装
1. 准备50毫升PBGT。有关说明，请参阅食谱。
2. 去除一抗稀释液，在室温下用400μlPBGT洗涤细胞三次，每次洗涤5分钟。
3. 在洗涤细胞的同时，在PBGT中稀释二抗，鬼笔环肽和DAPI。有关说明，请参阅食谱。
4. 去除PBGT，并向每个孔中加入300μl二抗稀释液。将板在室温下孵育1小时，避光或用铝箔包裹（见注6）。
5. 去除二抗稀释液，并在室温下在400μlPBGT中洗涤细胞三次，每次洗涤5分钟。在洗涤过程中将盘子保持在黑暗中。
6. 去除最终的PBGT洗涤液，并向每个孔中加入500μl蒸馏水，以便更容易地去除盖玻片并稀释盐含量。用镊子从孔中轻轻取下盖玻片。轻轻擦拭Kimwipe，从盖玻片边缘去除多余的液体。将盖玻片轻轻放在涂在载玻片上的一滴ProLong金刚石上，然后盖上盖玻片。在ProLong钻石固化之前，避免施加压力或打扰盖玻片。
7. 在室温下在黑暗中滑动固化过夜，并在2周内在倒置共聚焦显微镜上成像（见注7和8）。

数据分析

重要的是要注意分析图像时细胞质和其他细胞投射之间的差异，因为该方案还保留了应力纤维。我们将培养系统中的细胞色素分类为信号蛋白阳性，肌动蛋白阳性，长度为~10μm或更大，直径约200nm，而不是源自与盖玻片接触的细胞的基底表面。该最终标准对于细胞内酯的特异性鉴定是重要的，因为包括粘着斑的细胞粘附位点沿着细胞的基底表面保留应力纤维。应力纤维往往比细胞色素更加线性，并且通常被观察到附着在盖玻片的表面上（Vallenius，2013）。 Cytonemes可以在细胞的任何位置形成，并具有三维动态投影（图2和3）。在量化细胞色素时，区分这两个投影之间的差异非常重要。

图2.最大强度投影（MIP）允许准确表示细胞质投射。 A和B.用Hh转染的NIH3T3细胞。 A.单节NIH3T3细胞。 Cytoneme位置在焦平面内外漂移，并且看起来完全没有F-肌动蛋白（红色）。 B. MIP包括同一细胞中的细胞色素范围。对Shh（绿色）和F-肌动蛋白通道均观察到连续的细胞色素。比例尺=25μm。

图3. MEM-fix可保留应力纤维和细胞色素。 A-C。用Shh转染的C57BL / 6 MEF细胞。 A.整个细胞的MIP显示许多细胞投射，箭头显示应力纤维，而箭头突出显示细胞质。 B.细胞的基底部分显示应力纤维在所有方向上从细胞体辐射出来。箭头头部应力纤维仍然存在，而箭头细胞膜不存在。一些细胞色素也将存在于基底部分。 C.细胞的MIP，不包括附着于盖玻片的基部。看到Cytonemes定向于相邻细胞。没有箭头头部应力纤维，箭头细胞质存在。比例尺=25μm。

笔记

所提供的程序是针对NIH3T3细胞定制的，但可以应用于培养系统中的各种不同细胞系（如图1所示）。我们已将这种通用方案形式应用于多种细胞系，成功地保存和成像细胞质，甚至在改变特定细胞系要求的培养方法时也是如此。这包括小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），内髓集合管（IMCD3），HEK293T，IMR-32和SK-N-SH细胞。
我们用Lipofectamine 3000转染我们的细胞。为了最大化转染效率，将质粒DNA，P3000和Lipofectamine在Opti-mem培养基中培养，然后加入到血清和无抗生素的NIH3T3培养基中。在优化条件下，可以用任何质粒DNA和优选的转染试剂转染细胞。
应该注意的是，转染后并不总是需要细胞再接种。然而，根据我们的经验，它可以进行更清洁的免疫细胞化学成像，因为它可以去除任何死细胞和可能从细胞第一次接种后积累在盖玻片上的多余颗粒（图4）。该方案具有非常温和的洗涤步骤，并且不会去除太多碎屑。当对最终附着于盖玻片本身的细胞色素进行成像时，胰蛋白酶消化转染的细胞并重新播种变得更加重要。

图4.转染后再接种细胞减少非特异性颗粒荧光和细胞碎片。 A和B.用Shh转染的C57BL / 6 MEF细胞。 A.将MEF细胞接种到盖玻片上，转染，然后用抗Shh（绿色），鬼笔环肽染色以标记F-肌动蛋白（红色）和DAPI（蓝色）。 B.接种MEF细胞，转染，然后用胰蛋白酶消化并重新接种到盖玻片上，并用抗Shh，鬼笔环肽和DAPI染色。比例尺=25μm。
在熟悉此协议之前，建议您在每个实验条件下使用至少2个盖玻片。
如果使用悬浮细胞系或监测早期的cytoneme生长，您可以缩短时间段。
从这一点开始，保持细胞暴露在最低限度。
在共聚焦显微镜上进行图像采集时，建议采用多个Z步骤覆盖大部分细胞。 Cytonemes经常从整个Z轴的各个部分投射，并且可能从任何一个部分的焦平面掉出来。为了确保正确的完整细胞色素长度，代表细胞质长度和与其他细胞相互作用的图像应显示为细胞质的整个Z-范围的最大强度投影。
在图像采集和识别细胞色素期间，避免成像沿着细胞基部起始并保持与盖玻片接触的突起。这样可以防止在图像中包含应力纤维。

食谱

NIH3T3媒体
DMEM（4.5 g / L葡萄糖）补充10％BCS，~1％MEM NEAA，~1％L-谷氨酰胺，~1％Pen / Strep和~1％丙酮酸钠
要制作~550 ml NIH3T3培养基，请添加：
500毫升DMEM
50毫升HyClone TM Cosmic Calf TM 血清（BCS）
5毫升MEM NEAA
5毫升L-谷氨酰胺
5毫升笔/ Strep
5毫升丙酮酸钠至500毫升Stericup TM
将内容物真空过滤到接收瓶中，并在4°C下储存长达一个月
NIH3T3血清/无抗生素培养基
DMEM（4.5 g / L葡萄糖）补充~1％MEM NEAA，~1％L-谷氨酰胺和~1％丙酮酸钠
制作约500毫升NIH3T3培养基，添加：
500毫升DMEM
5毫升MEM NEAA
5毫升L-谷氨酰胺
5毫升丙酮酸钠至500毫升Stericup TM
将内容物真空过滤到接收瓶中，并在4°C下储存长达一个月
0.2 M二元磷酸钠溶液
制备1升0.2M磷酸氢二钠溶液，将28.392克磷酸氢二钠溶于1升超纯水中
0.2 M一元磷酸钠溶液
制备1升0.2M磷酸二氢钠溶液，将23.995克一元磷酸钠溶于1升超纯水中
改良电子显微镜固定剂（MEM-fix）
MEM-fix含有4％甲醛，0.5％戊二醛和0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）
制作10毫升MEM-fix：
1. 在15 ml离心管中混合8.1 ml 0.2 M磷酸氢二钠溶液和1.9 ml 0.2 M磷酸二氢钠溶液
2. 去除3.125毫升溶液，剩余体积为6.875毫升
3. 加入2.5毫升16％甲醛和625微升8％戊二醛
4. 在固定前立即将管反复混合并立即使用
透化缓冲区
透化缓冲液由5％正常山羊或驴血清组成（根据需要调整以适应所用的一抗）和0.1％Triton X-100，溶于蒸馏水中的1 mg / ml硼氢化钠溶液
制作10毫升透化缓冲液：
1. 将10mg硼氢化钠溶于15ml离心管中的10ml蒸馏水中。溶于水中的硼氢化钠释放出气体，因此确保盖子是半开的，以防止过量的气体积聚和离心管内的压力。
2. 取出600μl溶液，保留9.4 ml硼氢化钠溶液
3. 加入500μl普通山羊血清和100μl10％Triton X-100（用DPBS稀释）
4. 反转管多次混合。立即使用，不要与离心管盖密封存放
PBGT
PBGT由5％正常山羊血清，0.1％吐温-20在DPBS中组成
制作50毫升PBGT，加入并混合：
47毫升DPBS
2.5毫升普通山羊血清
将0.5ml 10％Tween-20（在DPBS中稀释）加入50ml离心管中注意：PBGT可以在4°C下储存数天，直到准备使用。
一抗解决方案
抗Shh的一抗稀释度为1：100 为24孔板的2个孔制备一抗溶液，在1.5 ml微量离心管中加入6μl抗Shh至600μlPBGT
注意：在使用前立即准备并使用一抗溶液。
二抗溶液
稀释1：1,000的所有二抗，1：2,000的DAPI溶液和1：400的鬼笔环肽，均在PBGT中稀释
注意：在使用前立即准备并使用二抗溶液。

致谢

这项工作得到了R01GM114049和R35GM122546对SKO，St. Jude癌症中心支持补助金NCI P30 CA021765以及St. Jude儿童研究医院的ALSAC的支持。该协议改编自最初在Bodeen 等人（2017）中描述的MEM-fix协议。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Bacallao，R.，Sohrab，S。和Phillips，C。（2006）。共焦荧光显微镜样本保存的指导原则。：生物共聚焦显微镜手册。施普林格，311-325。
Bodeen，W.J.，Marada，S.，Truong，A。和Ogden，S.K。（2017）。保存培养的细胞内分泌物的固定方法有助于对形态发生素转运进行机械询问。发展 144（19）：3612-3624。
Ramírez-Weber，F。A.和Kornberg，T。B.（1999）。 Cytonemes：投射到 Drosophila imaginal主要信号中心的细胞过程光盘。 Cell 97（5）：599-607。
Sanders，T.A.，Llagostera，E。和Barna，M。（2013）。专门的丝状伪足直接远程运输SHH脊椎动物组织模式。自然 497（7451）：628-632。
Stanganello，E.，Hagemann，A.I。，Mattes，B.，Sinner，C.，Meyen，D.，Weber，S.，Schug，A.，Raz，E。和Scholpp，S。（2015）。脊椎动物组织模式中基于Filopodia的Wnt转运。 Nat Commun 6：5846。
Tagliaferro，P.，Tandler，C.J。，Ramos，A.J.，Pecci Saavedra，J。和Brusco，A。（1997）。免疫荧光和戊二醛固定。基于席夫淬灭法的新程序。 J Neurosci Methods 77（2）：191-197。
Vallenius，T。（2013）。肌动蛋白应力纤维亚型在间充质迁移细胞中。 Open Biol 3（6）：130001。