材料和试剂

耗材
1. Eppendorf微量离心管1.5 ml（Eppendorf，目录号：0030121694）
2. Falcon，Conical Centrifuge Tubes 15 ml（Corning，目录号：352096）
3. 培养管5 ml（Lab Depot，目录号：TLDT8301）
4. Finntip移液器吸头（Finntip Flex 10,250,1,000和5 ml）
5. Whatman色谱纸（GE Healthcare，目录号：1001-931）
6. PVDF膜（默克，目录号：IPVH304F0）
植物材料
来自5周龄拟南芥的分离的类囊体（在所有缓冲液中存在10mM NaF时分离类囊体，如Järvi等人，2011中所述）。
试剂
1. 6-氨基己酸（Sigma-Aldrich，目录号：A2504）
2. Bis-Tris（Sigma-Aldrich，目录号：B4429）
3. 甘油（Avantor Performance Materials，J.T。Baker，目录号：7044）
4. Pefabloc SC，（4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐）（Roche Diagnostics，目录号：11585916001）
5. 氟化钠（NaF）（Avantor Performance Materials，J.T。Baker，目录号：3688）
6. EDTA二钠盐（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：1073）
7. Digitonin（默克，Calbiochem，目录号：300410）
8. n -dodecyl-β-D-maltoside（Sigma-Aldrich，目录号：D4641）
9. Serva Coomassie Blue G（SERVA电泳，目录号：35050）
10. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
11. Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
12. TEMED（四甲基乙二胺）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610801）
13. 液氮
14. 甲醇（VWR）
15. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
16. 丙烯酰胺（AA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9099）
17. （N，N'-亚甲基） - 双 - 丙烯酰胺（Bis-AA）（Merck，Omnipur，目录号：2610）
18. APS（过硫酸铵）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610700）
19. Tris（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
20. 甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：10070150）
21. SDS（VWR，目录号：442444H）
库存解决方案
1. 丙烯酰胺溶液A：MQ水中48％（w / v），1.5％（w / v）双丙烯酰胺，储存在4°C
2. 丙烯酰胺溶液B：MQ水中20％（w / v），5％（w / v）双丙烯酰胺，储存在4°C
3. APS（过硫酸铵）：在MQ水中的5％（w / v）溶液，储存在4°C
4. Digitonin原液：MQ水中10％（w / v），-20℃保存
5. β-十二烷基麦芽糖苷：MQ水中10％（w / v），-20°C储存
6. 甘油：在MQ水中的75％（w / v）溶液，储存在4°C
7. Pefabloc：在MQ水中10 mg / ml（w / v），储存在-20°C
8. 蔗糖：在MQ-水中的75％（w / v），储存在-20℃
缓冲区
1. 3x凝胶缓冲液，储存在4°C（见食谱）
2. 25BTH20G重悬浮缓冲液，准备新鲜（见食谱）
3. ACA缓冲液（见食谱）
4. 洗涤剂缓冲液A（4％Digitonin），准备新鲜（见食谱）
5. 洗涤剂缓冲液B（1％β-DM），准备新鲜（见食谱）
6. CBB缓冲液，-20°C（见食谱）
7. BN的阳极缓冲液，储存在4°C（见食谱）
8. 用于BN的蓝色阴极缓冲液，储存在4°C（见食谱）
9. 用于BN的透明阴极缓冲液，储存在4°C（见食谱）
10. 转移缓冲液，储存在4°C（见食谱）
11. BN-PA：3.5-12.5％分离凝胶，3％堆积凝胶（见食谱）
抗体
1. Lhcb1（Agrisera，目录号：AS01 004）
2. Phospho（P）-Lhcb1（Agrisera，目录号：AS13 2704）
3. Lhcb2（Agrisera，目录号：AS01 003）
4. Phospho（P）-Lhcb2（Agrisera，目录号：AS13 2705）

设备

双凝胶脚轮，10 x 8 cm板（Hoefer，目录号：SE215）
Hoefer梯度制造商SG5（或任何含有两个5毫升腔室的梯度制造商）
0.75 mm T型垫片（Hoefer，目录号：SE2119T-2-.75）
1 mm T型垫片（Hoefer，目录号：SE2119T-2-1.0）
样品凝胶梳，0.75 mm，10个孔（Hoefer，目录号：SE211A-10-.75）
2D梳子（扁平），带参考孔，1.0 mm厚
Mighty Small SE250立式电泳系统（Hoefer，目录号：SE250）
Ismatec IPC泵
电源，PowerPac HV（Bio-Rad Laboratories，目录号：164-5056）
离心机（Eppendorf，型号：5424R）
Finnpipette TM F2可变容量单通道移液器
冷室（4°C）
冰箱（-20°C）
照片扫描仪（例如，Perfection V300照片，爱普生，型号：V300）
Rocker-Shaker（Biosan，型号：MR-12，目录号：BS-010130-AAI）
半干印迹系统（Hoefer，目录号：TE77X）

程序

铸造BN-PA凝胶（线性梯度3.5％-12.5％分离凝胶; 3％堆积凝胶）
1. 根据制造商的说明，用10 x 8 cm板（图1A）组装凝胶连铸机（例如，Hoefer）。可以使用任何具有任何兼容铸造单元的垂直电泳系统。
2. 从丙烯酰胺储备溶液A（48％丙烯酰胺，1.5％双丙烯酰胺）中制备轻质（3.5％AA）和重质（12.5％AA）缓冲液（参见配方）。将溶液保存在冰上以防止不合时宜的聚合。用梯度制造器将凝胶浇铸在玻璃板和带缺口的氧化铝板（10×8cm）之间（图1B）。对于1D-BN-PAGE使用0.75 mm T-间隔物，对于2D-BN-PAGE使用1 mm T-间隔物。让梯度凝胶在室温下聚合1-2小时。
3. 使用丙烯酰胺储备溶液B（20％丙烯酰胺，5％双丙烯酰胺）浇铸堆积凝胶（3％丙烯酰胺）。使用合适的样品凝胶梳（1D-BN-PA凝胶：标准梳子，10孔，2D-BN-PA凝胶：2D梳子）。使堆积凝胶聚合30-60分钟。在MQ-水下取下样品凝胶梳。将凝胶保存在4°C。
  PAUSE POINT：凝胶可以在4°C下储存至少几天。凝胶不能干燥。
  
  图1.用于浇铸梯度凝胶的设备。 A. Hoefer双凝胶连铸机，配备所有必需的设备; B.梯度制造商，IPC泵和凝胶组装并准备凝胶浇铸。
类囊体膜的溶解（在昏暗的光线下进行溶解）
1. 在ACA缓冲液中重悬相当于3-7μg叶绿素的类囊体，叶绿素浓度为1 mg / ml。
2. 在样品上加入等体积的洗涤剂缓冲液A（4％洋地黄皂苷/ ACA）并在室温下溶解，在振荡器中连续温和混合10分钟，例如。最终的叶绿素浓度为0.5毫克/毫升。
3. 通过在18,000 x g ，4℃下离心20分钟沉淀不溶物质，将上清液移至新的Eppendorf管中。
4. 将1/10的CBB缓冲液加入样品中，并用移液管小心地混合。避免制造气泡。
用1D-BN-PAGE分离蛋白质复合物
1. 将凝胶装配到垂直电泳系统中，将~70 ml蓝色阴极缓冲液倒入凝胶罐（上室），将约100 ml阳极缓冲液倒入下室（图2）。
  
  图2.梯度凝胶组件示例凝胶在SE 250 Mini-Vertical电泳装置中组装。
2. 将相当于2-5μg叶绿素的类囊体加载到样品孔中。
3. 通过逐渐增加电压开始电泳运行，如下所示：
  1. 75 V 30分钟
  2. 100 V 30分钟
  3. 125 V 30分钟
  4. 150 V 60分钟
  5. 175 V 30分钟
  在4°C下进行电泳
4. 由于蓝色运行前沿已移动所需运行距离的约三分之一（约100-125 V），从上部腔室移除蓝色阴极缓冲液并用透明阴极缓冲液替换。
5. 当分离蛋白质复合物（B1-B9）（参见图6A）并且凝胶从蓝色阴极中清除时，停止电泳。
6. 用扫描仪扫描凝胶（扫描时将凝胶保留在玻璃和氧化铝板之间），取下玻璃板，用垫片仔细切出含有分离的蛋白质复合物的泳道（见图3中的草图）。不要使用手术刀或任何其他尖锐物体进行切割，以免划伤氧化铝板。
  PAUSE POINT：可以在-80°C下储存BN-凝胶条，但不要用液氮冲洗条带。
  注意：＆NBSP;
  1. 凝胶上加载的叶绿素量取决于随后的分析：对于免疫印迹，加载2μg（或更少）的叶绿素，对于3D-SDS-PAGE，加载5μg或更多的叶绿素。
  2. 也可以从BN-PA-凝胶上切下单个条带（复合物B1-B9），用1％β-DM重新溶解Eppendorf管中的条带，并使它们进行2D-BN-PAGE。＆nbsp;
  图3.用于2D-BN-PAGE的1D-BN条带的制备（1）完成1D-BN-PAGE后，取出玻璃板并切除含有蛋白质复合物的泳道（B1- B9）使用例如，T-间隔物。（2）小心地将凝胶条置于含有2ml洗涤剂缓冲液B（1％β-DM）的5ml培养管中。在振荡器中溶解40分钟。（3）将凝胶条放在第二个BN-PA凝胶（大孔）上，并将凝胶装配到电泳槽中。按照1D-BN-PAGE所述进行2D电泳。
2D-BN-PAGE
1. 将凝胶条放入培养管（5 ml）中，加入2 ml洗涤剂缓冲液B（1％β-DM）。
2. 将条带在4°C温和摇动下溶解40分钟，使条带均匀溶解（例如，20 rpm）。
3. 将条带放在第二个BN-PA凝胶上（见图3中的草图）并将凝胶装配到电泳槽中。
4. 按照1D-BN-PAGE所述进行电泳。
5. 电泳后用电子扫描仪扫描凝胶（参见图4中的2D-BN-PAGE草图，图5中的后续路径和图6B中代表性凝胶的扫描图像）。
  
  图4.类囊体蛋白复合物的2D-BN-PAGE分离。蛋白质复合物B1-B9（上部水平凝胶切片上的绿色条带）首先根据它们在1D-BN-的质量和形状分离页。分离后，将凝胶切片进行2D-BN-PAGE，在此期间将复合物（B1-B9）分级成亚复合物（2D-BN-凝胶上的窄绿色条带）。对角线上的复合物（虚线）表示保留其质量的复合物，而对角线下方的复合物是在第二次溶解和2D-BN-PAGE期间断开的亚复合物（B1-B9）。
  
  图5.实验程序流程图
2D原生凝胶的Western印迹
1. 将2D-BN-PA-gel置于转移缓冲液中并孵育30分钟。
2. 用100％甲醇活化PVDF膜并将膜置于转移缓冲液中。在转移缓冲液中浸泡六个Whatman滤纸。
3. 在电极（阳极）上组装三张纸。将膜放在纸的顶部，将凝胶放在膜的顶部。最后，将三张纸放在凝胶顶部并将阴极安装在顶部。将电流设置为1 mA / cm 2 凝胶区域，并转移至少1小时。
4. 用100％甲醇去除膜。
5. 用5％BSA封闭膜1小时。
6. 用特异性抗体进行免疫染色（参见图6C中的代表性印迹）。
  1. Lhcb1，Lhcb2，Lhcb3
  2. P-Lhcb1和P-Lhcb2
3D-SDS-PAGE
1. 切割含有亚复合物的泳道（对应于复合物B1-B9）。
2. SDS-PAGE上的蛋白质溶解和分离如Järvi et al。，2011中的2D-SDS-PAGE分析所述。
3. 电泳后，根据Blum 等人，1987，用Sypro Ruby Stain或银染法观察蛋白质（参见图6D的代表性3D凝胶，9种凝胶对应于复合物B1-B9）。

数据分析

对于所有实验（2D-BN-PAGE，3D-SDS-PAGE，Western印迹），我们使用三个生物学重复。
没有执行图像处理。根据（Aro et al。，2005; Suorsa et al 。，2015）。
代表性数据（图6）来自最初的研究文章（Rantala et al。，2017）。

图6.类囊体蛋白复合物的亚复合物和亚基组成分析的代表性结果。 A.在1D-BN-PAGE分离后，洋地黄皂苷溶解的类囊体的蛋白质复合物（B1-B9）。 B.通过用β-DM重新溶解1D-条带获得的亚复合物的2D-BN-PAGE分离。 Ctrl表示直接用1％DM溶解的类囊体。 C.通过电印迹2D-BN-凝胶并用Lhcb1，Lhcb2，Lhcb3蛋白特异性抗体和Phospho-Lhcb1-2蛋白特异性抗体对印迹进行免疫印迹来分析蛋白质亚复合物中的Lhcb蛋白定位。 D.通过从2D-BN-凝胶切割泳道并使凝胶条经受3D-BN-PAGE来分析亚复合物的蛋白质组成（衍生自复合物B1-B9）。用Sypro Ruby染色显示蛋白质。这个数字最初发表在Rantala et al。（2017）。

笔记

该协议在我们手中具有高度可重复性。
必须根据制造商的说明纯化Digitonin。我们对洋地黄皂苷没有任何问题，但洗涤剂原料在熔化时可能很容易沉淀。
类囊体分离（Järvi et al。，2011中的方案）必须从新鲜叶子中进行以获得高质量的类囊体蛋白质复合物。
将类囊体样品冷冻和解冻数次会影响蛋白质复合物的稳定性。

食谱

注意：所有溶液均在MQ水中制备。

3x凝胶缓冲液
1.5 M 6-Aminocaproic acid
150 mM Bis-Tris
25BTH20G
25 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
20％（w / v）甘油
0.25 mg / ml Pefabloc（新鲜加入）
10 mM NaF（新鲜添加）
ACA缓冲区
25 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
375 mM氨基己酸
1 mM EDTA
0.25 mg / ml Pefabloc（新鲜加入原液）
10 mM NaF（新鲜添加）
洗涤剂缓冲液A
4％洋地黄皂苷（w / v）
25 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
375 mM氨基己酸
1 mM EDTA
0.25 mg / ml Pefabloc（新鲜加入原液）
10 mM NaF（新鲜添加）
洗涤剂缓冲液B
1％β-十二烷基麦芽糖苷（w / v）
25 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
20％（w / v）甘油和
0.25 mg / ml Pefabloc（新鲜加入原液）
10 mM NaF（新鲜添加）
CBB缓冲区
100 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
0.5 M ACA
30％（w / v）蔗糖
50 mg / ml Serva Blue G
阳极缓冲区
50 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
阴极缓冲剂
50 mM Tricine
15 mM Bis-Tris / HCl（pH 7.0）
0.01％Serva Blue G
转移缓冲区
39 mM glysine
48 mM Tris
0.0375％SDS
20％甲醇
10. BN-PA：3.5-12.5％分离凝胶，3％堆积凝胶*

注意：
1. 10％APS水溶液必须新鲜或冷冻保存。
2. 该配方适用于0.75 mm凝胶，将配方乘以1.5，用于1 mm凝胶。
3. 在冰上制备溶液以防止不合时宜的聚合。

致谢

该研究得到了芬兰科学院（项目编号307335和303757），欧盟资助的创新培训网络（ITN）太阳能生物质能（SE2B）MarieSkłodowska-Curie拨款协议（675006）和DPMLS的财政支持。该协议改编自出版物（Rantala et al。，2017）。我们声明没有相互冲突或相互竞争的利益。

参考

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